Produção de protótipo de Ensaio Imunoenzimático-ELISA para o diagnóstico da leishmaniose tegumentar americana: comparação entre antígeno solúvel de L.(V.)braziliensis e proteína quimérica multiepitopo de linfócitos Bvoltar para a edição atual

Introdução: Trata-se de um estudo de validação de método para diagnóstico da leishmaniose tegumentar americana-LTA por Ensaio Imunoenzimático-ELISA. O ELISA constitui método diagnóstico sorológico de fácil execução, baixo custo e muito utilizado na rotina diagnóstica de diversos agravos (1,2). A coleta de soro é um procedimento universalmente utilizado e o transporte e armazenamento de amostras sorológicas é bem estabelecido e regulado no Brasil. No entanto, não existe na Rede Pública de Saúde, até o momento, um método sorológico eficaz, em relação aos aspectos de acessibilidade, custo e desempenho, para o diagnóstico da LTA. O Laboratório de Pesquisa Clínica e Vigilância em Leishmanioses (LaPClinVigiLeish) do Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas (INI), Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz) possui experiência no atendimento de pacientes suspeitos de LTA, na assistência clínica como também laboratorial e utiliza esta técnica “in house”, com antígenos brutos (Abr) de Leishmania (Viannia) braziliensis para diagnóstico da LTA (3–5). Entretanto, este método necessita de padronização e validação para que possa ser descentralizado para outras unidades de atendimento laboratorial do país, principalmente porque a LTA não é uma doença que induza a produção de altos níveis de anticorpos. Adicionalmente, muitos pesquisadores investigam modelos antigênicos com proteínas sintéticas ou recombinantes, que possam apresentar vantagens não só em relação ao desempenho como também na facilidade de produção em larga escala (6–13). Neste contexto, a Universidade Federal de Minas Gerais desenvolveu uma proteína quimérica de epítopos de linfócitos B (QuLB), com resultados promissores, para uso em ELISA para diagnóstico da LTA. Sendo assim, este projeto propõe a padronização e avaliação de dois protótipos de ELISA utilizando os dois princípios antigênicos distintos supracitados (Abr e QuLB), comparando o desempenho de cada um deles e elegendo o melhor modelo como proposta para produção de kits diagnósticos para LTA. Objetivo geral: produzir e padronizar dois protótipos de kits para o diagnóstico sorológico da leishmaniose tegumentar americana, pelo método de ELISA. Objetivos específicos: produzir o antígeno bruto a partir de formas promastigotas de L.(V.) braziliensis (MHOM/BR/1975/M2903); avaliar a qualidade dos antígenos e adaptá-los à plataforma de produção de kits diagnósticos da Bio-Manguinhos; determinar os parâmetros de desempenho dos protótipos; montar os protótipos dos kits para futura validação. Metodologia: serão utilizadas 75 amostras de soro de pacientes positivos para LT confirmados por qualquer técnica parasitológica, atendidos no ambulatório do INI e 175 amostras de plasma de indivíduos saudáveis doadores de sangue provenientes do Hemorio. A produção do antígeno bruto será de acordo com Barroso-Freitas (3). Para avaliação e adaptação dos antígenos serão utilizadas técnicas de eletroforese desnaturante SDS-PAGE em gel NuPage 4 – 12% Bis-Tris (Novex®), dosagem dos antígenos pelo método colorimétrico do ácido bicinconínico (BCA)(14), titulação seriada dos antígenos e conjugados, bem como adaptação às soluções padrão de acordo com protocolos internos de Bio-Manguinhos. Para determinar os parâmetros (pontos de corte) cut-off e faixa cinza será construída uma curva ROC (“receiver operating characteristic”) para estimativa da área sob a curva como medida de acurácia, e a montagem dos protótipos ELISA serão de acordo com protocolo interno Bio-Manguinhos. Este projeto constitui parte do projeto principal intitulado: “Produção e avaliação de protótipo de Ensaio Imunoenzimático-ELISA para o diagnóstico da leishmaniose tegumentar americana: comparação entre antígeno solúvel de L.(V.)braziliensis e proteína quimérica multiepitopo de linfócitos B, aprovado na II Chamada PROEP/PEC FIOCRUZ CNPQ 30/20, processo 20445949/2020-1.