PRODUÇÃO DE PROTEÍNAS QUIMÉRICAS DE Dirofilaria immitis PARA AVALIAR O POTENCIAL USO NO DESENVOLVIMENTO DE UM TESTE DE CAPTURA DE ANTICORPOS PARA DIROFILARIOSE.voltar para a edição atual

Justificativa e relevância A prevalência da infecção por D. immitis em cães varia mundialmente, sendo 22.68% na Oceania, 12,07% na Ásia, 11,60% na América, 10,45% na Europa e 7,57% na África. A Espanha é o país que apresenta a maior prevalência (19,25%), enquanto o Canadá figura em último lugar com 0,16% (Anvari et al, 2020). No Brasil, a infecção em cães foi descrita em 15 locais hiperendêmicos das regiões Sul, Sudeste e Nordeste do país (Labarthe et al, 2014). A Dirofilariose canina chama atenção da indústria farmacêutica, pois existe um grande mercado anti-helmíntico potencial. Isso porque a prevenção anual gira em torno de $75 por cão e há um estimado número de 80 milhões de cães, somente nos Estados Unidos (APPA, 2012). O padrão ouro para o diagnóstico da Dirofilariose é o teste de detecção de antígeno circulante, porém há limitações quanto ao uso em cães com baixa carga parasitária de fêmeas, além da possibilidade da antigenemia ser suprimida até cerca de 9 meses pós infecção em cães tratados (AHS, 2014). Além disso, não há um teste de captura de anticorpos disponível comercialmente. Levando esses fatores em consideração, somado ao fato da importância epidemiológica e econômica da doença, este trabalho tem como objetivo produzir proteínas quiméricas de D. immitis para avaliar o potencial uso no desenvolvimento de um teste de captura de anticorpos para Dirofilariose. Objetivos Geral: Produzir proteínas quiméricas de D. immitis para avaliar o potencial uso no desenvolvimento de um teste de captura de anticorpos para Dirofilariose. Específicos: Obter as proteínas quiméricas purificadas; avaliar a sensibilidade, especificidade das proteínas quiméricas em ensaios de ELISA; comparar o desempenho dos testes produzidos aqui com os kits comerciais disponíveis. Metodologia Amostras de soro. Serão utilizadas 215 amostras de soro de cães provenientes do Departamento de Medicina Veterinária da UFRPE. As amostras utilizadas serão classificadas como positivas (positivo no teste SNAP Dirofilariose RT) e endêmicas negativas (negativas no teste SNAP Dirofilariose RT). Soros de cães com outras patologias, como Leishmaniose, deverão ser adicionados para avaliar a reação cruzada com outras doenças comuns. O projeto foi protocolado na CEUA da UFRPE sob o número 2726120521. Expressão e purificação das proteínas heterólogas. As construções dos genes quiméricos e o vetor pRSETA serão utilizadas para transformar células competentes de Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS e Rosetta™ 2 (Merck Millipore). A expressão dos genes será induzida por IPTG e as proteínas quiméricas serão purificadas por cromatografia, usando a resina Ni-NTA agarose (Qiagen). Ensaios imunoenzimaticos indireto (ELISA) in house. As placas serão sensibilizadas com os antígenos na concentração de 600 ng por poço. Após o bloqueio, os soros serão incubados na diluição de 1:100. Depois disso, haverá a incubação com os conjugados de anti-IgG canino e peroxidase. Então, a reação será revelada utilizando o substrato BD OptEIATM TMB (BD Biosciences, USA) e interrompida com H2SO4 1N. A leitura será realizada a 450nm e os resultados expressos em densidade óptica (OD). Os testes comerciais serão utilizados com o intuito de comparar com os testes desenvolvidos aqui. Análises estatísticas. Os parâmetros de sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo, negativo serão estimados através dos programas MedCalc (versão 12.3) e GraphPad Prism 6.0. O cutoff será determinado pela média do grupo verdadeiro negativo mais três vezes o desvio padrão desta média.