Padronização de metodologia de genotipagem em tempo real para o diagnóstico da malária: identificação de zoonose em áreas de Mata Atlântica Fluminensevoltar para a edição atual

O Plasmodium vivax é o parasito predominante no Brasil, onde representa um grande problema de saúde pública, respondendo por 90% dos casos de malária. Embora no país o fardo da malária na região de Mata Atlântica (MA) seja consideravelmente menor do que na Amazônia Legal, a singularidade da transmissão nesta região, caracterizada como uma zoonose atribuída ao P. simium - parasito de primatas não-humanos, impõe novos desafios para a eliminação da endemia e pode ser o epicentro do possível surgimento de uma 7ª espécie de Plasmodium a estabelecer infecção no homem e, por isso, deve ser prontamente e precisamente diagnosticado. Os avanços nas tecnologias genômicas permitem o desenvolvimento de técnicas de diagnóstico e o acesso a um conjunto de dados mais aprimorados e criam oportunidades para fornecer informações sobre a origem da infecção e transmissão dos parasitos da malária que auxiliam o Programa Nacional de Controle da Malária a responder questões epidemiológicas importantes e a construir melhores estratégias de controle. Até a atualidade, a diferença entre o P. vivax cosmopolita e o P. simium são 2 nucleotídeos no DNA mitocondrial. No entanto, o único método descrito para diferenciar as espécies causadoras de infecção em humanos na MA se baseia em ensaio nested-PCR RFLP, que requer 2 reações de PCR seguida por digestão enzimática do produto e confecção de gel de agarose corado com brometo de etídeo. Esta técnica leva pelo menos 6 horas para obtenção de resultados, é realizada em um sistema aberto e, portanto, mais sujeito a contaminação, além de não se conhecer a sua precisão, que compreende os parâmetros de repetibilidade e reprodutibilidade. Ademais, os locais de reconhecimento destas enzimas são geralmente 4 a 6 pares de comprimento e por isso são menos restritas que uma sonda ou primer específicos, podendo haver o reconhecimento de regiões inespecíficas. Por isso, o ensaio que pretendemos desenvolver é uma genotipagem em tempo real através da técnica de real time PCR que é de simples execução, rápida e robusta, que consiste num sistema fechado sem manipulação pós-amplificação minimizando, portanto, o risco de contaminação e não necessita de géis de agarose para a leitura dos resultados, o que otimiza ainda mais o tempo de execução, que é de cerca de 1 hora, e evita a manipulação de agentes cancerígenos. Este ensaio permitirá ao CPD-Mal, único Centro de Referência da Malária na Extra-Amazônia, o acompanhamento dos casos oriundos de áreas de MA e ao longo do tempo gerará informações sobre a transmissão e avaliação das intervenções e, assim, complementar a vigilância malariométrica convencional. Nesse contexto, nos propomos a desenvolver um ensaio de genotipagem em tempo real para diferenciar P. vivax cosmopolita de P. simium para a demonstração da transmissão zoonótica de P. simium infectando seres humanos. A padronização do ensaio de PCR em tempo real, vai considerar conceitos e experimentos referenciados e adotados pelo Food and Drug Administration, EUA. O checklist incluem a otimização dos primers e o desenho da sonda, suas titulações, para estabelecimento das melhores concentrações de uso, o estabelecimento do limite de detecção, a sensibilidade analítica e a precisão. Testaremos 2 sistemas de PCR em tempo real, o sistema TaqMan que usa sondas MGB específicas para os alelos e; o sistema High Resolution Melting (HRM) que usa um corante fluorescente inespecífico dupla-fita de DNA, esse método é feito adicionando uma ciclagem pós-PCR que desnatura as fitas com alta resolução, a diferença na temperatura de desnaturação “melting” das fitas é capaz de identificar variações mínimas nas sequências de DNA. O protocolo desta pesquisa foi submetido e aprovado pelo CEP/IOC/Fiocruz sob o número CAAE 88554718.0.3002.5248.