CITOMETRIA DE FLUXO COMO MÉTODO DE DIAGNÓSTICO DA LEISHMANIOSE TEGUMENTAR AMERICANA UTILIZANDO ANTÍGENOS RECOMBINANTES DE Leishmania (Viannia) braziliensisvoltar para a edição atual

1 JUSTIFICATIVA/RELEVÂNCIA A Leishmaniose Tegumentar (LT) é uma doença negligenciada, considerada grave problema de saúde pública no Brasil e no mundo (OMS, 2019). Em Pernambuco, a LT é incidente em todo o estado, sendo predominante na Zona da Mata, com cerca de 65% dos casos registrados (FERREIRA, 2018). Uma das formas de controle é o diagnóstico precoce, porém os métodos atuais apresentam limitações, variando no desempenho (BRITO, 2020). Diante disso, a citometria de fluxo (CF), mediante a utilização de antígenos molecularmente definidos, destaca-se como uma alternativa promissora para um diagnóstico mais eficiente e preciso da LT. 2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS a) Obter os antígenos recombinantes de Leishmania (Viannia) braziliensis; b) Otimizar o protocolo dos ensaios de CF com o uso dos antígenos recombinantes; c) Avaliar a aplicabilidade da CF na identificação de pacientes portadores de LT ativa; d) Comparar performance dos testes de CF e ELISA, utilizando antígenos recombinantes, na detecção de portadores de LT ativa; e) Verificar a presença de reações cruzadas na CF utilizando amostras de pacientes com doenças que assemelham-se clinicamente à LT, e pacientes com Leishmaniose Visceral e Doença de Chagas 3. METODOLOGIA O estudo utilizará amostras de sangue de pacientes com LT ativa, residentes de áreas endêmicas para a doença em Pernambuco (n=30). Para a análise de reações cruzada serão utilizadas amostras de leishmaniose Visceral(n=30) e doença de Chagas (n=10). Os soros serão obtidos a partir da centrifugação do sangue coletado, inativados, e o sobrenadante será aliquotado e armazenado. Para o ELISA, será obtida a fração solúvel dos antígenos de L. (V.) braziliensis. A placa será sensibilizada com 100?L dos antígenos, e lavada com PBSTween20. Aos poços,serão adicionados 100?L do soro na diluição de 1:900. Em seguida, serão adicionados 100?L de anti-IgG humana conjugada, a placa será lavada e serão adicionados 150?L do cromógeno (OPD). Por fim, a reação será parada com 100?L de NaOH, e a leitura realizada. Para o acoplamento das proteínas recombinantes 0750 e 1140 (TAVARES, 2017) e da proteína quimérica PADRE (OLIVEIRA B.C., 2020) às partículas esféricas de poliestireno, serão adicionadas em um tubo 100?L das partículas e da proteína recombinante, e 1,8mL de PBS, deixados sob agitação. A misturá será centrifugada, e o sobrenadante será aliquotado e ressuspenso. O ensaio de CF será realizado para pesquisa de anticorpos anti-proteínas recombinantes de L. (V.) braziliensis. Em uma placa de 96poços fundo “U”, será adicionado as amostras de soro na diluição seriada(1:100 a 1:12800), e 20?L do produto do acoplamento (beads e proteínas recombinantes) e a placa será incubada. Posteriormente, serão adicionados 20?L do anti-IgGhumano conjugado, diluído na concentração de 1:200. Por fim, os sedimentos serão passados para tubos de citometria. Aquisições e análises serão realizadas em um citômetro de fluxo FACSCalibur. A análise estatística será realizada com os programas GraphPad PRISM e Flowjo. 4 CRONOGRAMA ETAPAS 2022 2023 1° 2° 1° Pesquisa bibliográfica X X X Ensaios de ELISA X X Ensaios de Citometria de Fluxo X X Análise dos resultados X X Conclusão do artigo para publicação X Elaboração do relatório final X 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ARONSON,N.E. et al. Cutaneous leishmaniasis:Updatesin diagnosis and management. Infectious Disease Clinics, v33, n.1, p. 101-117, 2019. DE BRITO,R.C.F. Recent advances and new strategies in Leishmaniasis diagnosis.Applied BRASIL.Manual de Vigilância da Leishmaniose Tegumentar Americana.Editora do Ministério da Saúde, 2017. TAVARES, et al. Avaliação da citometria de fluxo no diagnóstico das leishmanioses utilizando antígenos recombinantes. 114.Tese– Instituto Aggeu Magalhães, 2017.