Caracterização de panteteinases de Culex quinquefasciatus potencialmente envolvidas no modo de ação de larvicidas de Lysinibacillus sphaericus voltar para a edição atual

Resumo plano de trabalho PIBIC 2022-Resumo RAIC 2022 Título: Caracterização de panteteinases de Culex quinquefasciatus potencialmente envolvidas no modo de ação de larvicidas de Lysinibacillus sphaericus 1. Justificativa e relevância. Biolarvicidas à base do Lysinibacillus sphaericus têm sido utilizados com sucesso para o controle de culicídeos, e o principal fator inseticida é a protoxina, denominada Binária (Bin). A resistência de C. quinquefasciatus à toxina Bin já foi registrada e, na maioria dos casos, ela está associada à ausência do receptor Cqm1 no microvilli intestinal, pois a ligação toxina Bin-receptor é uma condição sine qua non para a ação do L. sphaericus. O nosso grupo de pesquisa selecionou, em laboratório, colônias de C. quinquefasciatus com alto nível de resistência à toxina Bin que têm servido como um modelo para a caracterização. Uma das colônias estudadas, R2362-A1, é formada por indivíduos homozigotos para um alelo do gene cqm1 (cqm1REC) cuja mutação impede a expressão de receptores Cqm1 no epitélio intestinal, e confere alta resistência à toxina Bin. Um estudo do transcriptoma de intestinos de larvas da colônia resistente revelou que o gene que codifica a enzima panteteinase (CPIJ017593) teve um nível de repressão mais acentuado do que o próprio receptor Cqm1. A nossa hipótese é que esta molécula desempenha um importante papel na ação da toxina Bin e esta é uma investigação inédita visto que não há qualquer descrição ou caraterizaçao desta proteína em insetos, muito menos de potencial envolvimento no modo de ação da toxina Bin. 2. Objetivos. Este estudo visa avaliar o perfil de transcrição da panteteinase em larvas de C. quinquefasciatus suscetíveis e resistentes ao biolarvicida L. sphaericus e contribuir para a caraterização desta molécula. Os objetivos específicos são: a) avaliar qualitativamente a presença de transcritos em diferentes fases do desenvolvimento dos insetos por transcrição convencional.b) quantificar e comparar os níveis de transcrição gênica entre amostras de larvas resistentes e suscetíveis por transcrição em tempo real. c) produzir antígeno da panteteina recombinante para futura análise de expressão desta proteína. 3. Metodologia. Serão utilizados indivíduos das colônias suscetível a inseticidas e da colônia R2362-A1 ao resistente ao L. sphaericus 2362 ; serão obtidas as amostras de DNA de diferentes indivíduos e fases de vida serão submetidas a avaliações de transcrição do gene pelos métodos convencional e em tempo real utilizando primers específicos para este gene, gene controle e demais procedimentos de rotina. A produção de antígeno sera obtida a partir de uma linhagem de Escherichia coli cepa BL21 transformada com o gene da panteteinase cultivada em meio Luria-Bertani (LB) sob indução com IPTG (Romao et al 2006). As proteínas recombinantes serao purificadas em resina de níquel para obter uma amostra de cerca de 1.5 mg. Esta sera usada como antígeno, para imunização e produção de anticorpos policlonais através da empresa CélulaB (UFRS). 4. Resultados obtidos até março 2022. Mesmo com o contingenciamento das atividades presenciais as seguintes etpas foram realizadas: leitura de material bibliográfico sobre ecologia de culicídeos, revisões sobre panteteinase, funcionamento de toxinas inseticidas e análises de transcrição gênica foram estudados; Curso Biossegurança em Foco; Participação nos seminários do departamento; participação nos seminários de biosegunraça para utilização específica do insetário e Laboratório do Departamento de Entomologia do IAM-FIOCRUZ; treinamento teóricos e práticos sobre a extração de RNA e qRT PCR utilizando as metodologias estipuladas para a pesquisa; treinamento insetário reconhecimento das fases das larvas a serem utilizadas neste projeto; treinamento específico de pipetagem em paraleo às extrações de RNA; extração de cerca de 70 indivíduos para analise de qRT-PCR; início do treinamento da técnica de qRT-PCR propriamente dita tórico e prático para dar incias às analises das amostras de RNA dos indivíduos já armazenadas. 5. Cronograma e referências. As informações completas inclusive cronograma e referências estão apresentadas no plano de trabalho completo em anexo.