Avaliação da produção de IFN-? por células T de indivíduos infectados com Plasmodium vivax, usando ELISpotvoltar para a edição atual

Justificativa Indivíduos infectados com Plasmodium não desenvolvem imunidade esterilizante e podem ter a doença sucessivas vezes (OPATA et al., 2018). Além disso, alguns indivíduos infectados com P. vivax podem desenvolver a forma assintomática (ALMEIDA et al., 2021), perpetuando a transmissão da doença (SLATER et al., 2019). Sabe-se que a função efetora de células T é crucial para a imunidade protetora contra a malária. Entretanto, estudos envolvendo humanos infectados com o parasito são escassos. Este subprojeto, portanto, visa avaliar a resposta de células T, avaliando-se a produção de IFN-?, de indivíduos naturalmente expostos sintomáticos e assintomáticos, usando ensaios de ELISpot. Relevância A erradicação da malária requer uma abordagem combinada envolvendo todas as ferramentas de controle disponíveis, diagnóstico de infecções assintomáticas e uma vacina eficaz capaz de induzir respostas imunes protetoras (GANESHAN et al., 2016). Sabe-se que o estudo da imunidade adaptativa celular em indivíduos infectados pelo P. vivax é complexo e mal compreendido. Dessa forma, a identificação de epítopos de células T imunodominantes neste estudo poderá determinar possíveis candidatos vacinais e de diagnóstico de infecções assintomáticas em áreas endêmicas de malária. Objetivos Avaliar a produção de IFN-? por células T de indivíduos incluídos no projeto (portadores assintomáticos, indivíduos saudáveis e pacientes com malária aguda) estimuladas com 19 bibliotecas de peptídeos de Plasmodium vivax utilizando-se ELISpot; Avaliar a produção de IFN-? por células T de indivíduos dos três grupos experimentais, frente a uma biblioteca de 310 peptídeos de Plasmodium vivax através de ELISpot; Correlacionar esses dados com demais dados clínicos e laboratoriais obtidos pelo grupo de pesquisa. Metodologia Amostras de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) de indivíduos dos grupos experimentais, pacientes sintomáticos e indivíduos assintomáticos e saudáveis, já foram coletadas e estão armazenadas a -80oC. Para a execução do ELISpot contra as bibliotecas de peptídeos será utilizado o protocolo padronizado por este grupo de pesquisa. Brevemente, placas multiscreen serão revestidas com anticorpos monoclonais anti-IFN-? humano diluídos em tampão bicarbonato. As placas serão incubadas a 4°C durante a noite e bloqueadas com RPMI por 1 hora. As placas serão subsequentemente lavadas 3 vezes com PBS 1X e PBMC (250.000 células/poço) de cada sujeito serão estimuladas com todos os pools de peptídeos. Posteriormente, as placas serão lavadas e incubadas com anticorpo monoclonal anti-IFN-? biotinilado por 2 horas; estreptavidina conjugada com fosfatase alcalina por 1 hora e, por fim, com um substrato cromogênico específico da enzima por 30 minutos à temperatura ambiente. O desenvolvimento da cor será determinado por lavagem das placas em água corrente e as placas secas ao ar à temperatura ambiente. Os spots serão contados utilizando o leitor de ELISpot. Análise estatística Os resultados serão compilados utilizando o software Excel e as análises estatísticas serão realizadas pelo Graphpad Prism 8.