Seleção de bactérias da microbiota de Aedes aegypti para modificação genética através da aplicação do sistema CRISPR/Cas9voltar para a edição atual

Uma vez que ainda não há vacinas amplamente disponíveis contra arbovírus que acometem po-pulações humanas, a principal maneira de evitar a sua transmissão é controlar os mosquitos vetores. As epidemias recentes de dengue, Zika e chikungunya demonstram que os métodos tradicionais de controle de Aedes aegypti, eliminação de criadouros larvares e uso de inseticidas, apresentam efetividade limitada. Deste modo, é urgente o desenvolvimento de novas metodologias para reduzir a transmissão destes patógenos. Neste cenário, a exploração da capacidade inata de alguns simbiontes para limitar a competência vetorial de mosquitos a arbovírus ou a modificação genética destes microrganismos para expressar moléculas capazes de produzir tal efeito (paratransgênese) surgem como uma alternativa. Nos últimos anos, a microbiota intestinal de Ae. aegypti foi identificada através de metodologias dependentes e independentes do cultivo bacteriano e seu efeitos na fisiologia e competência vetorial deste mosquito foram descritos, indicando possíveis bactérias candidatas à aplicação na redução da transmissão de arbovírus, como Asaia, Chromobacterium, Proteus e Paenibacillus. Neste sentido, ainda é necessário caracterizar a interação microbiota-hospedeiro para estes e outros simbiontes intestinais de Ae. aegypti, desvendando meios de aquisição e transmissão horizontal/vertical, localização em tecidos do hospedeiro, capacidade de espalhamento em populações do vetor, fatores genéticos essenciais para a colonização do hospedeiro e receptividade à manipulação genética. Recentemente, um estudo demonstrou que o sistema CRISPR/Cas9 pode ser aplicado para modificar geneticamente simbiontes intestinais de Aedes com o intuito de investigar as relações microbiota-hospedeiro. Assim, a integração de genes de marcação fluorescente nestes simbiontes pode revelar padrões de colonização de tecidos e transmissão vertical e horizontal. Além disso, a possibilidade de deletar e integrar genes em bactérias da microbiota sem comprometer o seu fitness é essencial para o desenvolvimento de abordagens de paratrangênese. Assim, este subprojeto tem como objetivos (a) realizar uma revisão bibliográfica acerca da competência vetorial de populações brasileiras de Ae. aegypti ao dengue e (b) selecionar e caracterizar geneticamente simbiontes intestinais de Ae. aegypti para futura aplicação do sistema CRISPR/Cas9, visando o estudo das relações hospedeiro-microbiota neste vetor. Para tal, Aedes aegypti adultos serão coletados com aspiradores no Rio de Janeiro. Após agrupados por ponto e data de coleta, fêmeas terão a superfície externa esterilizada em etanol 70% e lavada em tampão fosfato salino estéril (PBS). O intestino médio será removido e macerado em PBS. Cada amostra será diluída serialmente e plaqueada em meio de cultura LB-agar e Triptona de Soja Agar (TS-agar) em temperatura ambiente (~28ºC). Nas 72 h seguintes, as colônias bacterianas serão preservadas a -70ºC. O DNA das bactérias isoladas será extraído para amplificação e sequenciamento (Sanger) do gene 16S rRNA (>1000 pb) utilizando iniciadores universais para identificação taxonômica no programa Ribossomal Data Pro-ject Classifier. Será selecionada ao menos uma bactéria candidata, de gêneros frequentemente encontrados na microbiota de Ae. aegypti, a qual terá o genoma sequenciado em Illumina MiSeq (2x250bp paired-end). A montagem e anotação do genoma será feita utilizando o MIRA versão 4.0 e o pipeline RAST, respectivamente, seguidas por curadoria manual. A partir destes dados serão selecionados genes conservados para nocaute e regiões intergênicas para inserção de genes de marcação fluorescente via CRISPR/Cas9.