Análise funcional sistêmica de potencial erro inato da imunidade no gene RELAvoltar para a edição atual
Brenno dos Santos Gonçalves
Sob orientação de TAMIRIS AZAMOR DA COSTA BARROS e Daniela Prado Cunha
1. Justificativa e relevância
Erros Inatos da Imunidade (EII) são alterações raras no sistema imunológico que ocasionam o aumento da suscetibilidade às infecções, doenças auto-imunes, doenças auto-inflamatórias, alergia e/ou malignidade, afetando ~ 1 em 50.000 nascimentos (1). Recentemente foram descritos dois casos de haploinsuficiência em RELA resultando em inflamação muco cutâneas devido a ativação prejudicada de NF?B (Fator Nuclear kappa B), um dos principais indutores de mediadores inflamatórios (2).
Este subprojeto faz parte da investigação genômica funcional de um paciente com quadro auto-imune, caracterizado por infecções frequentes por Staphilococcus aureus que apresenta variante causadora de stop códon em um alelo do gene RELA. A associação do sequenciamento de RNA (RNAseq) ao exoma já é utilizada no diagnóstico de doenças raras (3). Aqui é proposta a análise da resposta leucocitária da paciente por RNAseq como estratégia de avaliação funcional sistêmica e validação dos achados genômicos, auxiliando na terapia personalizada.
2. Objetivos
2.1. Objetivo geral
Avaliar a resposta sistêmica de leucócitos provenientes de paciente com potencial EII em RELA frente a S. aureus.
2.2. Objetivos específicos
- Infectar in vitro leucócitos do paciente EII e controles saudáveis com S. Aureus;
- Produzir material para avaliação do perfil de expressão gênica global dos PBMCs infectados por RNAseq;
- Acompanhar análises de dados de expressão diferencial e enriquecimento.
3. Metodologia
3.1. Infecção in vitro de PBMCs do paciente com EII e controles saudáveis com S. Aureus
Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) da paciente e de controles saudáveis serão estimuladas por 4 horas com S. aureus (ATCC25923), acetato de miristato de forbol (PMA) + Ionomicina ou meio de cultura (Mock).
3.2. Extração de RNA
O RNA celular será extraído utilizando Kit RNeasy® (Qiagen). A quantidade e pureza das amostras de RNA serão determinadas por espectrofotometria (NanoDrop Technologies, EUA) e integridade por eletroforese em gel de agarose desnaturante.
3.3. Preparo de bibliotecas de cDNA
Resumidamente, o RNA mensageiro será isolado a partir do RNA total, seguido da síntese de bibliotecas de cDNA usando o kit RNA Truseq (Illumina) de acordo com as recomendações do fabricante. Após purificação e indexação os fragmentos serão avaliados por eletroforese em gel de agarose. O sequenciado ocorrerá no equipamento Illumina HiSeq™ 2000 (Plataforma de Sequenciamento de Ácidos Nucléicos de Nova Geração – FIOCRUZ).
3.4. Análises dos dados
As leituras brutas serão pré-processadas para remoção das sequências de adaptadores e sequências de baixa qualidade usando o pipeline Illumina GA v1.6 e alinhadas nos softwares Bowtie e TopHat. A biblioteca DESeq2 (4) será utilizada para análise da expressão gênica diferencial entre leucócitos da paciente vs. controle. Análises de enriquecimento no software Ingenuity Pathways Analysis (Qiagen), e plataformas Network Analyst e Reactome.
5. Referências Bibliográficas
1. Kobrynski L, Powell RW, Bowen S. Prevalence and Morbidity of Primary Immunodeficiency Diseases, United States 2001–2007. J Clin Immunol. 2014 Nov;34(8):954–61.
2. Badran YR, Dedeoglu F, Leyva Castillo JM, Bainter W, Ohsumi TK, Bousvaros A, et al. Human RELA haploinsufficiency results in autosomal-dominant chronic mucocutaneous ulceration. J Exp Med. 2017 Jul 3;214(7):1937–47.
3. Hirata M, Asano N, Katayama K, Yoshida A, Tsuda Y, Sekimizu M, et al. Integrated exome and RNA sequencing of dedifferentiated liposarcoma. Nat Commun. 2019 Dec;10(1):5683.
4. Love MI, Huber W, Anders S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 2014 Dec;15(12):550.