Família GH13: anotação gênica e caracterização da atividade de transglicosidase de uma ?-glicosidase de Lutzomyia longipalpisvoltar para a edição atual

Os flebotomíneos transmitem o parasita causador das Leishmanioses a hospedeiros vertebrados, através da picada de fêmeas durante a alimentação sanguínea. Os adultos possuem também uma dieta rica em açúcares, para atender às demandas energéticas necessárias ao desenvolvimento. As ?-amilase são enzimas importantes para a digestão em flebotomíneos adultos e na fase larval, uma vez que o amido é encontrado nas folhas de plantas e frutas e o glicogênio é o carboidrato de reserva de fungos. As ?-glicosidases são exoglicosidases que catalisam a hidrólise de ligações ?-1,4 e em insetos, estão envolvidas na digestão de sacarose obtida diretamente pela alimentação e na digestão de maltose, dissacarídeo gerado a partir da digestão de amido. Em altas concentrações de substrato estas enzimas podem realizar reações de transglicosilação e sintetizar oligossacarídeos. Este trabalho possui como objetivo a identificação no genoma de L. longipalpis e P. papatasi de genes que codificam glicosidases pertencentes a família GH13 e a caracterização da atividade de transglicosidase da ?-glicosidase digestiva de L. longipalpis. A seleção de genes GHF13 no genoma de L. longipalpis foi realizada na plataforma VectorBase utilizando o domíneo PFAM (PF00128). Os genes encontrados foram anotados por similaridade utilizando a ferramenta BLASTp nas plataformas Swiss-Prot/UniProt e PDB. Após identificação, as sequências foram analisadas pelos algoritmos THMM, signal IP, Big-PI predictor, NETOGlyc 4.0, NETNGlyc 1.0, Deep Loc e Compute pI/Mw. O alinhamento múltiplo com sequências homólogas foi realizado utilizando o algoritmo ClustalW para identificação das regiões catalíticas. A atividade de alfa-glicosidase foi determinada utilizando os substratos sacarose, maltose e trealose. Foram encontrados no genoma de L. longipalpis 14 genes que codificam ?-amilases, e 8 alfa-amilases para Phlebotomus papatasi. As alfa-amilases de L. longipalpis se organizam em 3 diferentes clusters que foram denominados cluster A, B e C. As proteínas LlAamyA2, LlAamyB5 e LlAamyB8 estão com sua sequência incompleta. Todas as alfa-amilases encontradas foram caracterizadas como enzimas presentes no meio extracelular/solúvel, apresentam um peptídeo sinal e indícios de sítios de N- e O-glicosilação. As massas moleculares das enzimas encontradas variaram de 54 a 56 kDa e ponto isoelétrico entre 4,4 e 6,5. Para as sequências de P. papatasi as regiões catalíticas foram corretamente identificadas nas proteínas, com a tríade ASP-GLU-ASP, para as enzimas de L. longipalpis algumas substituições foram encontradas no sítio catalítico, em especial nas alfa-amilases pertencentes ao cluster B. Foram encontrados no genoma de L. longipalpis 3 genes que codificam para ?-glicosidases e 9 genes no genoma de P. papatasi. Os genes estão identificados como LIMal1, LIMal2 e LIMal3. Para as proteínas LIMal2 e LIMal3, foram identificados peptídeo sinal e domíneo transmembrana, indicando que estas proteínas são secretadas e estão ancoradas à membrana plasmática, estando voltadas para o lúmem do intestino. O gene que codifica a proteína LIMal1 está incompleto. LIMal2 e LIMal3, apresentaram massas moleculares de 59 kDa e 70 kDa e pontos isoelétricos de 5,6 e 4,6, respectivamente. As três proteínas apresentaram indícios de sítios de N- e O-glicosilação. As regiões catalíticas foram corretamente identificadas nas três proteínas, indicando que estas enzimas encontram-se ativas no inseto. Os resultados demostraram que a alfa-glicosidase de L. longipalpis é capaz de hidrolisar todos os diferentes substratos testados. O conhecimento das enzimas digestivas desses flebotomíneos permite a obtenção de informações bioquímicas e fisiológicas importantes para o entendimento da biologia desses vetores, além disso, o conhecimento básico das características dessas enzimas pode nos permitir caracterizar alvos para o controle desses flebotomíneos.