Otimização da técnica SmMIT-LAMP e SmITS-LAMP para detecção da esquistossomose mansônica em amostras de fezes humanas.voltar para a edição atual

INTRODUÇÃO: A Esquistossomose é uma doença tropical negligenciada causada por helmintos do gênero Schistosoma, onde a espécie de maior importância no Brasil é o S. mansoni. A população atingida geralmente vive em condições socioeconômicas desfavoráveis e em locais com condições ambientais precárias. A transmissão se dá pelo contato com coleções hídricas de água doce na presença de caramujos infectados, que são hospedeiros intermediários e vetores desta parasitose. Para fazer o diagnóstico da esquistossomose existem métodos parasitológicos, moleculares ou imunológicos. O método padrão-ouro recomendado pelo ministério da saúde é o parasitológico “Kato-Katz”, porém esse teste apresenta uma baixa sensibilidade em pessoas com baixa carga parasitária, resultando em diagnósticos falso-negativos. Uma alternativa ao Kato-Katz é a reação em cadeia da polimerase (PCR), técnica molecular que faz a amplificação do DNA alvo do parasito na amostra. Mas devido a necessidade de profissionais treinados, equipamentos e reagentes caros tem seu uso limitado em locais com poucos recursos. JUSTIFICATIVA: A Amplificação Isotérmica Mediada por Loop (LAMP) é um tipo de PCR, porém é um teste mais rápido, econômico, sensível e específico que é mais aplicável em campo visto que é uma reação realizada em condições isotérmicas, o que reduz o seu custo e simplifica sua execução. A técnica de LAMP já foi utilizada em outro trabalho para o diagnóstico da esquistossomose, no qual apresentou uma boa sensibilidade e foi chamada de SmMIT-LAMP (FERNANDEZ- SOTO et al., 2014). Apesar das vantagens, o LAMP apresenta uma dificuldade de preservação dos reagentes que possuem um alto custo. Porém, essa desvantagem pode ser superada pela liofilização dos reagentes, o que pode aumentar seu tempo de conservação e diminuir riscos de contaminação da reação no diagnóstico. OBJETIVOS: O trabalho teve como objetivos: 1) otimizar a técnica de extração de DNA em amostras de fezes com fenol-clorofórmio; 2) Otimizar a técnica SmMIT-LAMP e SmITS-LAMP com reagentes previamente liofilizados; 3) avaliar a sensibilidade das técnicas com quantidades conhecidas de DNA genômico de S. mansoni em comparação a outros sistemas de PCR. RESULTADOS PARCIAIS: A técnica de extração foi otimizada e apresentou um melhor resultado quando realizada com duas etapas de fenol-clorofórmio, no qual apresentou uma razão 260/280 entre 1,8 e 2,0 para todas as amostras TEL 11 a TEL 20. Para a otimização da técnica SmMIT-LAMP foi realizada uma curva de sensibilidade que teve como valor mínimo detectado 100 pg, que foi muito menor do que era esperado para a técnica, visto que em outros trabalhos a sensibilidade relatada foi maior. Devido a isso foi realizado um teste com a técnica SmITS-LAMP adaptada do protocolo utilizado por Fernadéz-Soto et. al (2020). O resultado da curva de sensibilidade para o SmITS-LAMP foi muito superior ao SmMIT-LAMP, com uma sensibilidade de 10 fg. A partir disso foi realizada a liofilização dos reagentes para o SmITS-LAMP utilizando dois sistemas. O Sistema 1 com betaína e com a enzima DNA polimerase Bst 2.0 WarmStart liofilizadas juntamente com os reagentes e o Sistema 2 sem a betaína e sem a enzima liofilizadas, adicionadas apenas na hora do experimento. O resultado da liofilização foi satisfatório apenas para o Sistema 1, que apresentou amplificação com uma sensibilidade de 1 ng. PERSPECTIVAS: A técnica de SmMIT-LAMP já foi utilizada em outros trabalhos e mostrou bons resultados para o diagnóstico da esquistossomose, além de uma boa sensibilidade, apesar disso a técnica apresentou instabilidades na sensibilidade e foi substituída pela técnica SmITS-LAMP que apresentou resultados mais estáveis. A partir disso, o melhor resultado do experimento da liofilização com a técnica SmITS-LAMP, que foi apresentado no Sistema 1 e será explorado com um volume maior de amostra e também em duplicata. Com isso, espera-se um melhor resultado na sensibilidade para concluir a otimização da técnica.