Avaliação de proteínas quiméricas de Wuchereria bancrofti para o diagnóstico da filariose linfática.voltar para a edição atual

A Filariose Linfática (FL) é uma doença humana causada no Brasil pela W. bancrofti (Wb). Dados da Organização Mundial de Saúde (OMS), estimam que 1,4 bilhões de pessoas no mundo vivem sob o risco de adquirir a FL e existem cerca de 120 milhões infectadas. Os métodos de diagnóstico para essa doença apresentam limitações, os parasitológicos possuem baixa sensibilidade e precisam de horário específico para coleta sanguínea (23h-01h). Enquanto os imunológicos são importados, exibem persistência da positividade mesmo com eliminação da infecção, e custo elevado gerando ônus aos cofres públicos. A OMS pretende eliminar a FL até 2030, com atual sucesso em cerca de 17 de 81 países. Como o Brasil ainda é considerado endêmico para esta doença, é necessário um teste eficiente na detecção de anticorpos anti-filariais em indivíduos positivos produzido em território nacional para auxiliar na triagem da população e contribuir com o sucesso do programa. Testes que captam anticorpos são mais confiáveis em fase de vigilância, visto que os portadores podem apresentar quantidades baixas do antígeno. Com base no que foi citado, o objetivo do presente trabalho é desenvolver e validar um diagnóstico de captura de anticorpos anti-filarias baseado em proteínas quiméricas de W. bancrofti. Para tal, o primeiro passo será construir genes quiméricos que reúnam regiões antigênicas identificadas como relevantes para o diagnóstico da FL. As proteínas quiméricas serão formadas por regiões estimuladoras de linfócitos B e específicas para Wb oriundas de diferentes antígenos. Serão utilizados os programas ABCpred, BepPred e SVMTrip para a predição de epítopos de linfócitos B em proteínas individuais de W. bancrofti. Após a seleção das regiões antigênicas, será realizado e Blastp (NCBI) para excluir as sequências similares a outras espécies de parasitas, assim diminuindo a possibilidade de reação cruzada no diagnóstico. Então, partindo das sequências de aminoácidos selecionadas, será feita a construção dos genes quiméricos, através dos programas ApeDNA e Genedesigner. À princípio dois genes serão construídos, com a possibilidade de obtenção de 4 tipos de proteínas diferentes para cada gene, totalizando 8 possíveis antígenos recombinantes quiméricos a serem testados. Então, os genes serão clonados nos vetores de expressão da série pRSET (Invitrogen), através dos sítios múltiplos de clonagem. Por conseguinte, as construções geradas serão utilizadas para transformar células competentes de Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS e Rosetta™ 2 (Merck Millipore). A expressão das proteínas quiméricas será estimulada por IPTG e estas serão purificadas por cromatografia de troca iônica utilizando a resina Ni-NTA agarose (Qiagen), que se ligará a cauda de polihistidina da proteína. De posse das proteínas purificadas, será realizado o ELISA indireto com soros de indivíduos positivos e negativos pra FL. Para cada antígeno, serão avaliados os parâmetros de sensibilidade e especificidade, além de valor preditivo positivo e negativo. O cutoff será determinado como a média da densidade óptica (OD) do grupo negativo mais três vezes o desvio padrão desta média. As proteínas com melhores resultados serão enviadas para o Laboratório pertencente a Biomanguinhos (FIOCRUZ-RJ), onde serão produzidos o teste rápido e o ELISA comercial. Estes serão encaminhados de volta para a FIOCRUZ- PE, onde serão realizados os testes de eficiência. Depois disso, os mesmos serão avaliados com um número maior de soros oriundos de outras regiões endêmicas através de colaborações em andamento. Os testes também serão examinados por pessoal não treinado, assim descartando qualquer suposto resultado falso-positivo ou negativo. Ao final do projeto, espera-se produzir um teste do tipo ELISA e imunocromatográfico com valores maiores do que 90% de sensibilidade e especificidade. Com isso, produzir o primeiro teste comercial para a FL brasileiro, que apresente melhores parâmetros do que aqueles disponíveis comercialmente.