Análise de reservas energéticas em linhagens de Aedes aegypti suscetíveis e resistentes a inseticidasvoltar para a edição atual

JUSTIFICATIVA E RELEVÂNCIA O uso de inseticidas é uma ferramenta crucial para o controle do Aedes aegypti, vetor de dengue, Zika e chikungunya. Contudo, o uso exacerbado destes compostos tem exercido uma forte pressão seletiva para a emergência de populações resistentes aos inseticidas. A resistência a inseticidas (RI) é atualmente uma ameaça ao controle do Ae. aegypti em escala global.[1] A RI pode ocorrer por alterações fisiológicas no organismo do inseto (ex: enrijecimento da cutícula do exoesqueleto, aumento no potencial de detoxificação de xenobióticos e mutações na molécula-alvo do inseticida). No entanto, diversos estudos têm relatado que estas alterações afetam de forma negativas aspectos gerais do desenvolvimento e da reprodução do inseto. Isso porque a pressão de seleção com inseticidas seleciona os poucos indivíduos que naturalmente apresentavam alterações que provavelmente não lhes trariam vantagens em um ambiente livre de inseticida. Portanto, o inseto resistente tende a ser menos competitivo do que o susceptível.[2] Nosso grupo tem identificado populações naturais de Ae. aegypti resistentes a inseticidas, bem como selecionado linhagens resistentes em laboratório,[3,4] identificado marcadores moleculares para genotipagem dos mecanismos selecionados[5,6] e avaliando o efeito da RI no fitness do inseto.[7,8] Pretendemos contribuir para esclarecer um ponto controverso na literatura sobre se esses efeitos deletérios no inseto resistente estão relacionados a um desvio energético (trade-off) das funções fisiológicas “naturais” para suprir as necessidades das alterações selecionadas. Dispomos de linhagens de Ae. aegypti bem caracterizadas e ensaios padronizados para a dosagem de moléculas energéticas. Com a possibilidade de retorno às atividades presenciais, após a pausa em função das implicações da sindemia de COVID-19, este subprojeto tem como principal objetivo retomar a condução dos experimentos no laboratório, iniciados por outra estudante, e analisar os efeitos da resistência a inseticidas sobre as reservas energéticas de linhagens de Ae. aegypti, com diferentes genótipos associados à resistência a piretroides (mutações kdr, do inglês knockdown resistance). OBJETIVOS ESPECÍFICOS I. Manutenção de linhagens de Ae. aegypti II. Genotipagem de mutações kdr III. Quantificação de moléculas de reservas energéticas; METODOLOGIA Utilizaremos linhagens de Ae. aegypti mantidas no LAFICAVE, provenientes de populações que apresentam diferentes níveis de RI (Oiapoque, Macapá e Caseara, respectivamente, muito resistente, resistente e susceptível).[9,10] Com relação aos mecanismos de resistência, focaremos em kdr, que são mutações no gene do canal de sódio regulado por voltagem (NaV), que conferem resistência a piretroides. Oiapoque possui dois alelos kdr (R1 e R2), Macapá apenas um (R1) e Caseara não apresenta kdr (alelo S). Mosquitos da linhagem Rockefeller (referência de susceptibilidade e vigor) serão usados como controle interno experimental. Todas as linhagens de mosquitos serão mantidas em insetário com temperatura de 26 ± 1ºC, umidade relativa de 70 ± 10% e fotofase de 12 horas.[11] Para mensuração de moléculas relacionadas com armazenamento e geração de energia (glicogênio, lipídeos e proteínas) larvas com 24 horas após eclosão dos ovos serão transferidas para um recipiente (aproximadamente 50 larvas por recipiente) contendo 200 mL de água desclorada e 0,1 g de ração para peixe (Tetramin Marine®). Serão mantidos três recipientes (replicata técnica) por linhagem. Após três dias, as larvas (L3) serão separadas, lavadas com água desclorada, e individualmente congeladas à -70°C para posterior dissecção de cabeça e corpos, sendo os corpos usados na análise das moléculas energéticas de acordo com o protocolo estabelecido por Foray et al. (2012).[12] Serão avaliadas pelo menos 30 larvas de cada linhagem, em três momentos distintos (total de 90 larvas por linhagem). As cabeças das larvas serão utilizadas para extração de DNA com tampão de lise de TNES e lavagens em etanol. A genotipagem de kdr será conduzida conforme feito por Costa et al. (2020),[5] a partir de qPCR. Os valores de glicogênio e lipídeos serão normalizados pelo conteúdo proteico das respectivas larvas. Testaremos se as concentrações dessas moléculas acompanham os níveis de RI das linhagens e se os valores energéticos de cada larva correlacionam com seu respectivo genótipo kdr, buscando evidências de trade-off energético possivelmente causado pela mutação.