Novas abordagens moleculares em Trypanosoma cruzi para estudos sobre a progressão e tratamento da doença de Chagasvoltar para a edição atual

A doença de Chagas é considerada negligenciada, o benznidazol é a única droga usada no tratamento no Brasil e causa sérios efeitos colaterais e possui baixa eficácia. Na busca de novos compostos para tratamento são necessárias vários testes in vitro e in vivo, entretanto, é necessário que sejam padronizados métodos rápidos e confiáveis de avaliação de novas drogas em larga escala. Portanto, é necessário investir no desenvolvimento de novos métodos de avaliação e no uso de novas tecnologias. Com esse objetivo produzimos cepas de T. cruzi Dm28c, expressando a enzima luciferase (Dm28c-Luc) e a proteína fluorescente EGFP (Dm28c-EGFP), ferramentas importante para padronização de novos métodos de análise de compostos. Complementando e substituindo técnicas mais tradicionais, como a contagem de células infectadas com T. cruzi e coradas com hematoxilina/ eosina, para avaliação da taxa de infecção e da eficácia do quimioterápico. Ensaios preliminares da padronização dos testes in vitro, foram realizados para determinar a quantidade ideal de células de linhagem celular LLCMK2 e as condições de cultivo, para os ensaios de infecção e tratamento com compostos. Amastigotas intracelulares das cepas Dm28c-Luc e Dm28c-EGFP, utilizando o inibidor da biossíntese de ergosterol, posoconazol, demonstraram que as cepas Dm28c-Luc, Dm28c-EGFP, foram capazes de infectar as células LLC-MK2 e de manter a infecção com o aumento do número médio de amastigotas intracelulares após 72 horas de infecção, em comparação com a cepa selvagem e Dm28c-WT. O IC50 para as amastigotas intracelulares em células LLC-MK2 infectadas com T. cruzi cepa Dm28c-WT, foi estimado em 1,25 a 2,9 nM para o posaconazol utilizando índice de infecção em células coradas (dados não publicados), conforme descrito anteriormente para amastigotas da cepa Y em macrófagos peritoneais, cujo IC50 foi de 1 nM (Veiga-Santos et al, 2012). A padronização em leitor de microplaca, em amastigotas intracelulares de LLC-MK2 infectadas com as cepas Dm28c-Luc e Dm28c-EGFP foram realizadas utilizando a mesma curva de concentração com posaconazol, 05 a 50 nM. Experimentos iniciais demonstraram que após tratamento com posaconazol o IC50 ficou na faixa de 1,8 e 3,5 para amastigotas de Dm28c-Luc (n=2), e 3,7 nM para o Dm28c-EGFP (n=1), entretanto, em células infectadas com Dm-EGFP o backgorund foi mais elevado e a sensibilidade foi reduzida mesmo com o aumento da relação parasita célula de 10:1 para 100:1. Portanto, a cepa Dm28c-Luc apresenta uma vantagem em termos de melhor sensibilidade para avaliar mesmo pequenas alterações em relação ao número de células infectadas quando comparado com a cepa Dm28c- EGFP. Entretanto, a avaliação por fluorescência, utilizando a cepa Dm28c- EGFP pode ser de grande auxílio na primeira avaliação de uma bateria de compostos. Em seguida, a avaliação e estimativa do IC50 utilizando a bioluminescência é capaz de fornecer resultados mais precisos. A padronização dos ensaios em amastigotas intracelulares das cepas Dm28c-Luc e Dm28c-EGFP em leitor de microplaca, é uma metodologia de maior reprodutibilidade e confiabilidade, reduzindo os viéses metodológicos relacionados com a contagem de células, e será utilizado para a avaliação de extratos de plantas da família Piperaceae no leitor de microplaca.