Desenvolvimento e validação de um método para triagem de média vazão para descoberta de novos “hits” e “leads” para o tratamento da leishmaniosevoltar para a edição atual

A identificação de candidatos a fármacos antileishmaniais que sejam novas entidades químicas, preferencialmente com novos mecanismos de ação, é essencial para o enfrentamento deste grave problema de saúde pública. Os ensaios de triagem convencionais são dispendiosos e trabalhosos, porque dependem da exaustiva contagem ao microscópio óptico e da experiência do analista, o que torna inviável a análise de um grande número de compostos. Para superar os gargalos da triagem antiparasitária convencional, vários ensaios com genes repórteres vem sendo utilizados, incluindo ?-galactosidase, ?-lactamase e luciferase. Os parasitos também já foram marcados com proteínas fluorescentes, como a proteína fluorescente verde (GFP), mCherry, tdTomato e DsRed. O emprego de gene repórter aliado ao ensaio de triagem de alta vazão (HTS) também tem sido utilizado como uma ferramenta poderosa para descoberta de fármaco. Entretanto, o custo desta tecnologia é extremamente elevado, o que aumenta o gasto global empregado na descoberta e desenvolvimento de fármaco. Assim, o desenvolvimento de um ensaio de média vazão, utilizando Leishmania expressando constitutivamente uma proteína fluorescente, é justificado para um laboratório de pequeno porte que atue no desenvolvimento de fármacos para a leishmaniose. Vários protocolos de ensaio fenotípico foram desenvolvidos utilizando promastigotas, amastigotas axênicas ou amastigotas intracelulares para avaliar a atividade de substâncias naturais e sintéticas. Todas três formas do parasito citadas apresentam vantagens e desvantagens, mas a técnica padrão ouro para triagem in vitro é o ensaio baseado em amastigotas intracelulares. A partir deste ponto de vista, o presente trabalho tem como parte de seu objetivo desenvolver e validar uma metodologia de triagem de média vazão sobre amastigotas intracelulares de L. amazonensis-GFP. O intuito desse ensaio é possibilitar a triagem de um banco de derivados. Assim, esse projeto se divide em duas etapas: a padronização e validação do método e o seu emprego na fase inicial da descoberta e desenvolvimento de um novo fármaco (triagem, seleção de hits, estudo pré-clinico em modelo de leishmaniose cutânea experimental, otimização do hit e toxicidade).