Análise de silenciamento gênico e expressão de proteínas do vírus da hepatite B de portadores em diferentes estágios da infecção, via RNA de interferência.voltar para a edição atual

Apesar da existência de uma vacina eficiente, estima-se que de 2 bilhões de pessoas no mundo já tenham sido infectadas pelo vírus da hepatite B (HBV), e que existam cerca de 260 milhões de portadores crônicos. Essa infecção é responsável por aproximadamente um milhão de óbitos ao ano devido a quadros graves de cirrose e carcinoma hepatocelular (HCC). Baseado em uma divergência >7,5% no genoma completo, o HBV é classificado em 9 genótipos confirmados (A-I), e um putativo décimo genótipo (J). Estes são, por sua vez, subdivididos em subgenótipos com distribuição geográfica distintas, e diferentes impactos na progressão clínica e resposta ao tratamento. Atualmente, diversos fármacos são utilizados no tratamento da hepatite B crônica, no entanto, a eficiência da terapia esbarra em fatores como efeitos colaterais severos, seleção de vírus resistentes, e mesmo nos casos de sucesso, a cura completa ainda é alvo de controvérsias. O grande desafio reside no fato de que o DNA circular covalentemente fechado (cccDNA) viral, produzido após a entrada do vírus no hepatócito, não é afetado pelas drogas atualmente licenciadas. A molécula de cccDNA é um intermediário replicativo altamente estável, utilizado para a produção de novos vírus. Além disso, esse vírus tem a capacidade que de integrar seu DNA no genoma do hospedeiro, o que possibilita a reativação da infecção a qualquer momento da vida do paciente. O objetivo desse estudo é investigar diferenças na eficiência replicativa e expressão de proteínas entre os isolados do vírus da hepatite B de diferentes genótipos em cultura celular, para futuramente avaliarmos a suscetibilidade de cada genótipo ao silenciamento gênico, via RNA de interferência. Para tanto, 25 amostras de diferentes genótipos e subgenótipos do HBV circulantes no Brasil e no mundo foram selecionadas. Essas amostras terão o DNA do HBV extraído por kits comerciais e amplificado por Reação em Cadeia da Polimerase. Os genomas completos obtidos serão utilizados para clonagem molecular e produção do cccDNA para transfecção em cultura de células Huh7. As análises comparativas de eficiência replicativa entre os genótipos serão realizada através da quantificação do DNA do HBV em sobrenadante da cultura celular e análise da expressão de proteínas virais. Os resultados aqui obtidos serão uma etapa fundamental para se compreender a suscetibilidade ao silenciamento gênico dos diferentes genótipos do HBV, via RNAi.