Identificação de mutações em pmrAB e phoPQ com papel funcional em resistência a polimixinas em isolados clínicos MDR de Klebsiella pneumoniaevoltar para a edição atual

As polimixinas (PMs) têm ação potente sobre várias bactérias Gram-negativas, mas seu uso foi praticamente abandonado devido aos efeitos colaterais adversos. No entanto, com a disseminação global de linhagens resistentes aos carbapenemas e à falta de novos antimicrobianos, as PMs estão novamente em uso, como antibióticos de último recurso. Como consequência, a resistência a essa classe de antimicrobianos aumentou, o que é motivo de grande preocupação. A resistência a PMs é majoritariamente causada por mutações nos sistemas de dois componentes (SDCs) PhoPQ e PmrAB ou por inativação de MgrB, repressor de PhoQ. SDCs modulam diversos processos biológicos bacterianos: um sinal ambiental (ex metais, pH) dispara autofosforilação da histidina kinase sensora e a transferência do fosfato para uma proteína reguladora de resposta (RR). Uma vez fosforilados, os RR modulam a transcrição de seus genes alvo. Mutações em phoPQ e pmrAB de Klebsiella pneumoniae (KP) são importantes pois resultam em ganho de função, mediante ativação constitutiva dos operons arnBCADTEF, pmrE e pmrCAB, que codificam as enzimas responsáveis pelas modificações no LPS associadas a resistência à polimixina. Em um amplo estudo com 149 isolados de KP PM-R da Coleção de Bactérias de Infecção Hospitalar (albergada no LAPIH), identificamos 54 mutações não sinônimas nos genes de phoPQ e pmrAB, das quais 13 ocorrem em isolados que apresentam o gene mgrB intacto. Isto é relevante pois MgrB mantém PhoQ inativo, de modo que sua inativação (por mutações ou inserção de IS), também resulta em resistência ao deixar PhoPQ permanentemente ON. Vários destes isolados foram identificados em clones de grande relevância epidemiológica, dada sua ampla distribuição no Brasil (Neto et al., submetido). No intuito de revelar as bases bioquímicas e estruturais de como as substituições em PmrAB e PhoPQ causam resistência, em um projeto mais amplo (coordenado pela coorientadora T. Galvão e financiado pela Rede Internacional do Instituto Pasteur), é essencial saber quais destas 13 substituições por si só conferem resistência a PMs. Adicionalmente, este subprojeto contribui a elucidar quais das quase duas centenas de substituições descritas em PhoPQ e PmrAB em isolados clínicos resistentes a polimixinas (PM-R) de fato conferem resistência. Portanto, o objetivo deste projeto é identificar quais das mutações identificadas na Coleção do LAPIH causam resistência, gerando conhecimento sobre as bases moleculares deste processo e contribuindo ao desenho de testes de diagnóstico baseados em ácidos nucleicos. Objetivo geral Identificar as substituições em PmrAB e PhoPQ de isolados clínicos de KP PM-R da coleção do LAPIH com papel funcional em resistência. Objetivos específicos Mapear as substituições escolhidas nas regiões funcionais e domínios estruturais de PmrAB e PhoPQ. Gerar plasmídeos codificando as mutações escolhidas, mediante mutagênese sítio dirigida. Verificar o impacto das substituições na CIM de PMs. Metodologia Análise computacional Foram gerados modelos de PmrAB pelo AlphaFold, e as substituições que ocorrem em regiões funcionais estão sendo mapeadas. Em paralelo, ClustalW foi usado para realizar um alinhamento das sequências de PmrAB e PhoPQ com as do SDC homólogo HK853/RR486. A partir do qual está sendo feita uma comparação da posição das substituições escolhidas com as de amino ácidos equivalentes em diferentes estruturas HK853/RR486 resolvidas por cristalografia de raios X, e equivalentes a diferentes estados funcionais. Mutagênese sítio dirigida Plasmídeo carreando o operon phoPQ foi adquirido de empresa de síntese (FastBio). O plasmídeo carreando o operon pmrAB será adquirido da mesma empresa. As 12 mutações selecionadas serão introduzidas por SDM Quikchange e os plasmídeos serão transformados na cepa KP MGH 78578. CIM de polimixinas As cepas recombinantes de KP serão testadas com o método padrão ouro, de microdiluição em caldo, como descrito no documento M07-A10 do CLSI (BrCast 2020).