Utilização de fluorescência para avaliação da atividade antimalárica de compostos-teste in vivo.voltar para a edição atual

A determinação da atividade de potenciais antimaláricos in vivo é realizada no modelo murino, onde é possível se avaliar o metabolismo, a farmacocinética e as propriedades físicas preditivas de uma terapia oral. O padrão ouro utilizado para avaliação da atividade de drogas em camundongos experimentalmente infectados com Plasmodium é a contagem da parasitemia em esfregaços corados por microscopia óptica. No entanto, esse processo é demorado, requer técnicos experientes e não é automatizado. Portanto, a padronização de um método que utilize fluorescência como forma de substituir a contagem em microscópio apresenta vantagens como: (i) maior rapidez na triagem de potenciais antimaláricos, e a (ii) diminuição de resultados inconsistentes que podem ser influenciados por fatores humanos. O objetivo do presente trabalho foi otimizar um ensaio baseado na fluorescência do fluoróforo SYBR Green I (SYBRG), que é um intercalante de DNA, como descrito anteriormente (Arias et al. 2016), onde a fluorescência se apresenta diretamente proporcional à carga parasitária e inversamente proporcional a ação da droga-teste. Para isso, utilizamos camundongos suíços infectados experimentalmente com a cepa NK65 de Plasmodium berghei, em um inóculo de 107 hemácias infectadas. O tratamento com antimaláricos padrões foi realizado no 2°, 3° e 4° dia após a infecção, e a retirada do sangue pela porção final da cauda dos animais para ser incubado com SYBR green I (SYBRG), ou para a realização de esfregaços foi feita no 5° dia. Para testar o limite de sensibilidade do teste de fluorescência, utilizamos inicialmente o antimalárico cloroquina, e, posteriormente, o artesunato, já que a detecção de parasitemias apenas superiores a 1,4% (Arias et al. 2017) seria uma grande limitação caso tivéssemos amostras que apresentasse parasitemias baixas como aquelas encontradas em drogas ativas como os antimaláricos. Sob as nossas condições, que foi a utilização de sangue total, a diluição de SYBRG em tampão de lise, e a posterior incubação por 1 h à temperatura ambiente e sob abrigo da luz, houve a diferenciação de 1,38 a 4,35x entre a fluorescência de amostras de sangue de animais normais e infectados com o P. berghei nos cinco diferentes ensaios já realizados. Para testar a sensibilidade do teste foram realizadas três diferentes curvas de cloroquina, em doses que variaram de 1,25 a 10 mg/Kg. Os valores de r2 do coeficiente de Pearson dos três ensaios foram de 0,8918, 0,8916 e 0,9302 o que representa uma correlação forte e muito forte entre as técnicas de fluorescência e microscopia. Já nas duas curvas de artesunato realizadas, o valor de r2 referente ao coeficiente de Pearson foi de 0,9486 e 0,9785, correspondendo a uma correlação muito forte entre as duas técnicas realizadas. Nosso próximo passo será testar outros antimaláricos, além de extratos de plantas e compostos sintéticos e comparar os resultados obtidos na fluorescência com aqueles obtidos no teste supressivo de Peters (1965), que é o padrão ouro para avaliação de potenciais antimaláricos em camundongos experimentalmente infectados. Financiado pelo PIBIC/CNPq/FIOCRUZ, CNPq, FAPEMIG e IRR.