Identificação de tripanosomatídeos em amostras de cães soro reagentes para Leishmaniose Visceral e de pulgas coletadas destes cães utilizando métodos moleculares para análise.voltar para a edição atual

A Leishmaniose Visceral Canina (LVC) é uma doença parasitária de grande importância na medicina veterinária e na saúde pública. Sabendo disso, muitos estudos são feitos acerca do ciclo do tripanosomatídeo, seus vetores e reservatórios. É de consenso científico que a transmissão natural do agente etiológico da doença, o protozoário da espécie Leishmania infantum, ocorra principalmente pela picada de fêmeas de flebotomíneos da espécie Lutzomyia longipalpis, outros mecanismos de transmissão provavelmente estejam envolvidos na epidemiologia da LVC. Tendo isso como hipótese, o projeto tem como objetivo descobrir se as pulgas da espécie Ctenocephalides felis felis possuem capacidade vetorial, ou alguma importância no ciclo da Leishmania infantum. Pois a alta prevalência de cães infectados em regiões endêmicas com a baixa taxa de infecção natural por L. infantum no vetor biológico, reforça a hipótese da participação de outro vetor na transmissão do parasito e explica a ineficácia das medidas de controle que são direcionadas somente para o combate de L. longipalpis. Assim, o objetivo é avaliar a presença de Leishmania e outros possíveis tripanosomatídeos em pulgas retiradas de cães soro-reagentes para L. infantum e confirmar a infecção desses animais com diagnósticos moleculares. Para as análises das pulgas vem sendo usados os alvos kDNA, ITS1, hsp70 e v7v8 e para as amostras caninas, o alvo hsp70 para a PCR convencional e HaeIII para a RFLP. De 126 cães avaliados de área endêmica, 64.3% (81/126) apresentaram infestação por pulgas e foram coletadas desses animais 858 pulgas para as análises moleculares. Como resultados parciais das pulgas, para a PCR convencional utilizando o alvo kDNA, obtivemos 38.9% (67/172) de amostras positivas. Posteriormente, foram realizadas PCR-RFLP utilizando alvos mais específicos, aos genes hsp70 e ITS1 e a enzima de digestão HaeIII para comparar os padrões de amplicons obtidos. Os perfis de restrição obtidos pela digestão da enzima foram comparados com padrões obtidos pela digestão dos produtos de PCR de cepas referência de L. amazonensis (IFLA/BR/67/PH8), L. braziliensis (MHOM/BR/75M2903), L. infantum (MHOM/BR/74/PP75), L. guyanensis (MHOM/BR/75/M4147), Leptomonas collosoma (COLPROT073), Crithidia fasciculata (COLPROT 048), Herpetomonas samuelpessoai (COLPROT 067), Endotrypanum monterogei (COLPROT 151) e Blechomonas ayalai. Através desta metodologia, não foi possível obter conclusões específicas, pois os alvos utilizados não foram suficientemente específicos para diferenciar com clareza as espécies detectadas. Deste modo, iniciou-se o uso do alvo v7v8, região mais indicada e mais utilizada para análises filogenéticas dentro da família Trypanosomatidae quando não se conhece a espécie encontrada. Assim, 30% (260/858) das amostras, já foram submetidos à PCR convencional utilizando o alvo v7v8. Destas, 13% (35/260) das amostras, apresentaram amplicons próximos de 700 a 800pb, sendo este padrão esperado para amostras destes parasitos. Para identificar as espécies encontradas, as amostras positivas na PCR para o alvo v7v8 serão enviadas para sequenciamento e, posteriormente, serão feitas as análises filogenéticas. Para as amostras dos cães, até o momento foram analisadas 39.2% (49/125) das amostras de pele, destas, 46.9% (23/49) foram positivas para L. infantum utilizando a PCR-RFLP com o alvo hsp70, a análise do restante das amostras está em andamento. Desta forma, até o momento foi observado que as pulgas são hospedeiras de tripanosomatídeos, mas ainda não foi possível determinar as espécies presentes e os cães vem se confirmando positivos para L. infantum através de métodos moleculares.