Quantificação da carga parasitária em amostras coletadas de borda interna e externa de lesões cutâneas ulceradas de pacientes com leishmaniose tegumentar americanavoltar para a edição atual

II - JUSTIFICATIVA E RELEVÂNCIA A leishmaniose cutânea (LC) é uma doença infecciosa, causada por parasitos do gênero Leishmania. Segundo as recomendações da OMS e do Ministério da Saúde, o local de eleição para coleta de material para diagnóstico da LC, é a borda da lesão, pois supõe-se que essa localização contenha a maior quantidade de parasitos (OMS, 2010; BRASIL, 2017). Entretanto, a dispersão dos parasitos na lesão de LC tem sido rediscutida (RAMIREZ et al., 2000, ADAMS et al., 2014; SUAREZ et al., 2015). Nosso grupo tem estudado a distribuição parasitária na lesão, de Mello et al. (2011) avaliaram 110 pacientes empregando a escarificação de lesão cutânea ulcerada observando por microscopia ótica maior sensibilidade para o procedimento realizado na borda interna da lesão. Posteriormente, Thomaz et al. 2020 avaliaram essas mesmas amostras pela qPCR e confirmaram maior carga parasitária nesse local associada a maior necrose na análise histopatológica. Alguns aspectos ainda necessitam ser estudados mais profundamente com o auxilio de outras técnicas e incluindo todos os locais da lesão como o centro da úlcera. Esse trabalho tem como objetivo avaliar a carga e a viabilidade parasitária a partir de fragmentos de tecido obtidos de borda interna, externa e centro de lesões ulceradas de LC. Os resultados obtidos podem constituir evidências para novas diretrizes nacionais na conduta diagnóstica da LC. III - OBJETIVOS Objetivo geral Quantificar a carga parasitária utilizando a técnica de qPCR, e avaliar a viabilidade de Leishmania sp pela RT-qPCR em espécimes clínicos obtidos a partir de amostras coletadas de diferentes locais de lesões ulceradas de LC. Objetivos específicos a) Realizar revisão bibliográfica sobre a distribuição parasitária na lesão ulcerada de LC; b) Realizar a extração de DNA e RNA; c) Quantificar e comparar empregando a qPCR, a carga parasitária; d) Avaliar a viabilidade parasitária empregando a RT-qPCR através dos transcritos do gene 7SLRNA a partir de fragmentos de tecidos obtidos por biópsias da borda interna, externa e centro de lesões ulceradas suspeitas de LC; e) Avaliar e correlacionar os resultados com tempo de evolução de lesão e desfecho clínico; IV – METODOLOGIA Aspectos éticos e Delineamento do estudo Este estudo possui aprovação do CEP/IOC/FIOCRUZ (30323520.4.0000.5248) e se trata de uma análise transversal de um estudo de coorte. A população do estudo será constituída de pacientes que apresentarem lesões cutâneas ulceradas sugestivas de LC atendidos no período de 06/20 até 06/23 no INI/Fiocruz. Técnicas Laboratoriais A biópsia da lesão será realizada pelo médico e será retirado um punch de 3mm da borda interna, externa e centro da lesão sob anestesia local. Os fragmentos serão acondicionados em RNA later®. Para obtenção do RNA e DNA, será utilizado o método do Trizol associado a coluna RNeasy mini Kit. O RNA será quantificado pelo nanodrop® e, posteriormente, tratado com DNase I. A transcrição reversa será realizada a partir de 2,0 µg de RNA tratado, utilizando o Superscript IV Vilo®. A quantificação absoluta da carga parasitária (qPCR) nos sítios de lesão será realizada com base em diluições seriadas da curva padrão a partir de formas promastigotas de L. Braziliensis, utilizando primers direcionados ao kDNA (Weirather et al., 2011 ). E será realizada a quantificação do gen normalizador ?-actina humana (RODRIGUES et al, 2011). Para RT-qPCR, serão utilizados 100ng de cDNA por poço em triplicata. Será realizada uma quantificação relativa e os resultados serão expressos em 2-??Ct (fold change), entre amostras da borda interna, externa e centro. Serão utilizados iniciadores que amplificam a região do gen 7SLRNA de Leishmania (ZELAZNY et al., 2005), e iniciadores que amplificam o gene de referência GAPDH. Controles negativos e controles da reação de transcrição reversa serão adicionados a cada reação realizada. Todas as reações serão realizadas em triplicata utilizando o termociclador StepOne® sistema Sybrgreen.