Caracterização de panteteinases de Culex quinquefasciatus potencialmente envolvidas no modo de ação de larvicidas de Lysinibacillus sphaericus voltar para a edição atual

1. Justificativa e relevância. Biolarvicidas à base do Lysinibacillus sphaericus têm sido utilizados com sucesso para o controle de culicídeos, e o principal fator inseticida é a protoxina, denominada Binária (Bin). A resistência de C. quinquefasciatus à toxina Bin já foi registrada e, na maioria dos casos, ela está associada à ausência do receptor Cqm1 no microvilli intestinal, pois a ligação toxina Bin-receptor é uma condição sine qua non para a ação do L. sphaericus. O nosso grupo de pesquisa selecionou, em laboratório, colônias de C. quinquefasciatus com alto nível de resistência à toxina Bin que têm servido como um modelo para a caracterização. Uma das colônias estudadas, R2362-A1, é formada por indivíduos homozigotos para um alelo do gene cqm1 (cqm1REC) cuja mutação impede a expressão de receptores Cqm1 no epitélio intestinal, e confere alta resistência à toxina Bin. Um estudo do transcriptoma de intestinos de larvas da colônia resistente revelou que o gene que codifica a enzima panteteinase (CPIJ017593) teve um nível de repressão mais acentuado do que o próprio receptor Cqm1. A nossa hipótese é que esta molécula desempenha um importante papel na ação da toxina Bin e esta é uma investigação inédita visto que não há qualquer descrição ou caracterizaçao desta proteína em insetos. 2. Objetivos. Este estudo visa avaliar o perfil de transcrição da panteteinase em larvas de C. quinquefasciatus suscetíveis (S) e resistentes (R) ao biolarvicida L. sphaericus e contribuir para a caracterização desta molécula. Os objetivos específicos são: a) quantificar e comparar os níveis de transcrição gênica entre amostras de larvas resistentes e suscetíveis por transcrição em tempo real. b) quantificar e comparar os níveis de transcrição gênica entre amostras de adultos (machos e fêmeas) resistentes e suscetíveis por transcrição em tempo real. c) produzir antígeno da panteteina recombinante para produção de anticorpos e futura análise de expressão desta proteína. 3. Metodologia. As amostras de DNA serão obtidas individualmente de larvas e adultos das colônias suscetível e colônia REC. Estas serão submetidas a avaliações de transcrição quantitativa do transcrito da panteteinase em tempo real utilizando primers específicos para este gene e do gene controle. A produção de antígeno será obtida a partir de uma linhagem de Escherichia coli cepa BL21 transformada com o gene da panteteinase cultivada em meio Luria-Bertani (LB) sob indução com IPTG, segundo protocolo padrão. As proteínas recombinantes serão purificadas em resina Ni-NTA. Uma amostra de cerca de 1.5 mg será usada como antígeno, para imunização e produção de anticorpos policlonais através da empresa CélulaB (UFRS). 4. Resultados obtidos até março 2023. Em novembro 2022 houve substituição da bolsista e ingresso do atual aluno Yuri Silva levando a necessidade de treinamento e retomada dos ensaios de transcrição. Neste período o bolsista realizou todas as etapas de treinamento de biossegurança, de insetário para manipulação das colônias de Cx. quinquefasciatus, técnicas de extração e avaliação de RNA, ensaios de RT-qPCR e análise da expressão relativa de transcritos. Conforme descrito em relatório mais de cem amostras de RNA de larvas das duas colônias com avaliação quantitativa e qualitativa foram produzidas. Parte destas amostras, consideradas adequadas conforme critérios pré-estabelecidos (n= 38), foram utilizadas para a avaliação do perfil de transcrição. Após análise ao resultados válidos mostraram a expressão da panteteinase nas larvas S (n=15), com perfil variável em relação à amostra de referência. Já a expressão desta molécula nas larvas R (n= 9) foi significativamente inferior demonstrando um padrão de repressão e confirmando a hipótese deste estudo. A amostra de larvas já analisada (n= 24) será ampliada para 60 e em seguida será obtido o padrão de insetos adultos para a obtenção de um painel de transcrição de indivíduos das duas colônias nas fases jovem e adulta.