Caracterização de potenciais sítios de ubiquitinação identificados nos fatores de tradução EIF4G3 e EIF4G4 de tripanossomatídeosvoltar para a edição atual

As doenças causadas por tripanossomatídeos patogênicos, que inclui gêneros como Trypanosoma e Leishmania, são geralmente crônicas, de difícil tratamento e causam, anualmente, danos à saúde e econômicos imensos a diversas comunidades. Estima-se que cerca de 1 bilhão de pessoas estejam vivendo em áreas de risco de contaminação por esses organismos, especialmente em países mais pobres e emergentes, incluindo o Brasil. O tratamento contra esses agentes causadores ainda é muito limitado, com drogas que podem se tornar tóxicas com o passar do tempo, assim, a produção de conhecimento sobre a biologia dos tripanossomatídeos pode iluminar novos caminhos para o desenvolvimento de fármacos e tratamentos menos agressivos. A biossíntese de proteínas é um processo vital para a expressão gênica e sobrevivência celular e sua primeira etapa, a iniciação da tradução, é altamente complexa e requer regulação por diversas proteínas conhecidas como Fatores de Iniciação Eucarióticos (eIFs). Dentre esses fatores, o complexo eIF4F tem papel fundamental no recrutamento do ribossomo para o mRNA. Os elementos do complexo eIF4F têm sido investigados como possíveis alvos terapêuticos, tanto em tripanossomatídeos quanto em outros organismos, e resultados de estudos com inibidores de componentes deste complexo se mostram promissores em estratégias de combate a doenças. O complexo eIF4F é formado por três subunidades: eIF4A (RNA helicase), eIF4E (proteína de ligação ao cap) e eIF4G (proteína-scaffold). Vários homólogos de cada subunidade foram descritos em tripanossomatídeos, com cinco eIF4Gs identificados em T. brucei, sendo conservados em outros outros membros da família. Dois deles, EIF4G3 e EIF4G4, são essenciais para a viabilidade celular e estão envolvidos na tradução ativa. Evidências experimentais também indicaram que a abundância desses dois homólogos de eIF4G é potencialmente regulada por mecanismos proteolíticos, como, por exemplo, os que envolvem a via ubiquitina-proteassoma. Para avaliar isso, buscamos gerar linhagens de células de T. brucei expressando versões mutantes dos fatores EIF4G3 e EIF4G4 que possam ser afetados em sua proteólise. Nos anos anteriores desse projeto, as sequências proteicas de EIF4G3 e EIF4G4 foram submetidas à predição de sítios de ubiquitinação in silico usando ferramentas online, como UbiSite, UbiPred e BDM-PUB e AlphaFold2. Os resíduos de lisina (K) com as melhores avaliações in silico foram selecionados para serem substituídos por alaninas através de mutagênese dirigida ao sítio. Um total de cinco sítios foram selecionados para EIF4G3 e para EIF4G4, os quais serão avaliados in vivo. Para isso vetores de expressão contendo os genes mutados serão transfectados por eletroporação em uma linhagem de T. brucei que expressa uma molécula de ubiquitina conjugada ao epítopo HA (UbHA). As linhagens celulares resultantes serão verificadas por western blotting para confirmar a expressão do fator mutante e da ubiquitina recombinante. O próximo passo será avaliar o fenótipo das linhagens e a possível interferência das mutações sobre a ligação covalente da ubiquitina aos fatores EIF4G3 e EIF4G4, o que será avaliado por meio de ensaios de imunoprecipitação com anti-HA, seguidos de western blotting. A abordagem pretende validar o potencial preditivo da análise in silico para identificar sítios de ubiquitinação em T. brucei. Nossos resultados também ajudarão a esclarecer os mecanismos que regulam os níveis citosólicos dos homólogos selecionados de eIF4G e seu impacto na regulação da expressão gênica em tripanossomatídeos, podendo identificar pontos de controle importantes que podem ser explorados como alvos moleculares para o desenvolvimento de fármacos.