Bioprospecção de componentes ativos do veneno de serpente Crotalus durissus para estudos in silico e in vitro contra o alvo molecular Tripanotiona redutase de Leishmaniavoltar para a edição atual

Os venenos de serpentes são uma combinação de diversas proteínas e enzimas, que possuem ações tanto em presas como em vítimas, onde o principal objetivo é afetar os sistemas fisiológicos vitais de suas presas. Muitas dessas proteínas executam múltiplos papéis importantes, como matar ou imobilizar presas, bem como auxiliar no processo de digestão. Contudo, há décadas que pesquisas vêm transformando algumas dessas toxinas em uma fonte terapêutica. No Brasil, devido à grande biodiversidade, apresenta um vasto campo para bioprospecção de venenos de serpentes, com destaque para os gêneros Bothrops e Crotalus. Levando em consideração, o grande potencial para pesquisa de novas biomoléculas provenientes desses venenos, onde a composição pode ainda ser influenciada por fatores de alimentação, idade da serpente e localização geográfica onde se encontra, é necessário explorar os venenos, com técnicas de isolamento e purificação, juntamente às ferramentas alternativas como a bioinformática, de modo a auxiliar no tratamento de doenças infecciosas e parasitoses como a Leishmaniose. Portanto, o objetivo é investigar a Tripanotiona redutase de Leishmania braziliensis como alvo molecular para prospecção de novos inibidores: Avaliação de componentes ativos da serpente Crotalus durissus com atividade antiparasitária. Metodologias de Bioquímica, Biologia Molecular, Bioinformática, Biotecnologia e Biologia celular serão utilizadas para (i) obter a enzima recombinante tripanotiona redutase (TRLb-Leishmania braziliensis) na forma ativa e elevado grau de pureza; (ii) identificar moléculas de veneno da serpente Crotalus durissus com atividade inibitória sobre a capacidade catalítica da TRLb; (iii) avaliar atividade leishmanicida contra L. amazonensis e L. braziliensis (promastigotas e amastigotas); e (iv) avaliar as interações in vitro e in silico entre o alvo molecular e os inibidores. Por meio do programa Clustal W, temos a sequência do RNA mensageiro identificada de 1475 pb (chromosome: 5; NC_009298.2 LBRM_05_0350), e a correspondente sequência de aminoácidos do alvo a ser expresso (XP_001561849.1; EC 1.8.1.12). A partir da sequência de aminoácidos codificados pela TRLb, será realizado um alinhamento múltiplo com sequências pertencentes a L. panamensis, L. infantum, L. donovani, L. mexicana, L. major, L. brucei e T. cruzi. O processo de síntese e otimização do gene de interesse no vetor de expressão será realizado pela empresa FastBio®. Para obtenção do plasmídeo recombinante, a sequência correspondente a TRLb será inserida no vetor de expressão pET 28(a+) (Novagen®). À sequência será adicionada uma região codificante de polihistidinas (6x) e sítios de restrição para as enzimas NcoI e XhoI. Estas enzimas serão previamente selecionadas após verificação dos sítios de corte na sequência será utilizado o programa Web Cutter®. A propagação do plasmídeo recombinante e transformação bacteriana, por meio de duas cepas de E. coli, sendo uma delas para replicar o plasmídeo (TG1), e a outra para realizar a expressão da enzima [BL21 (DE3)], utilizando choque térmico. A Recuperação do plasmídeo recombinante da TR e quantificação, por meio das células da cepa TG1 de E. coli transformadas com o vetor recombinante pET 28(a+)TRLb para amplificação. Análise da expressão da tripanotiona redutase recombinante utilizando técnica eletroforética e a purificação da enzima recombinante expressa, empregando a cromatografia por afinidade em resina de níquel Ni-NTA (ácido níquelnitrilotriacético) Agarose (QIAGEN®), seguindo as instruções do fabricante. Após isolada a tripanotiona, serão realizados os testes para a avaliação da atividade inibitória, seguindo a ordem: (i) avaliação da atividade enzimática da tripanotiona redutase recombinante utilizando espectrofotômetro Eon Biotek® e o software Gen5®, de acordo com o protocolo de atividade previamente descrito e em colaboração com o Laboratório de Protozoología da Universidade Federal de Santa Catarina e (ii) avaliação da atividade inibitória para frações e/ou toxinas isoladas específicas de venenos de serpente. Para os testes in vitro, serão realizados os ensaios de atividade antipromastigota contra Leishmania amazonenses e Leishmania braziliensis. As formas promastigotas de L. amazonensis (cepa IFLA/BR/67/PH8) e L. braziliensis (cepa MHOM/BR/2014/310), obtidas da Coleção de Leishmania do Instituto Oswaldo Cruz serão mantidas congeladas até o momento do uso no banco da mencionada plataforma.