Desenvolvimento e caracterização de nanopartículas contendo 17-DMAG, inibidor da HSP90, como potencial quimioterápico no controle da infecção in vitro por Leishmania braziliensisvoltar para a edição atual

As leishmanioses são doenças negligenciadas cujos tratamentos incluem a aplicação de antimoniais pentavalentes, anfotericina B, entre outros. Esses tratamentos apresentam limitações como alto custo, tempo prolongado e efeitos colaterais que, em conjunto, evidenciam a necessidade do desenvolvimento de novos fármacos. A proteína de choque térmico 90 (Hsp90), uma chaperona molecular, surge como um alvo quimioterápico para o tratamento da leishmaniose. Estudos do nosso grupo mostraram que inibidores da Hsp90 foram eficazes contra Leishmania spp., em doses não tóxicas para o hospedeiro, in vivo e in vitro. Em estudo ainda não publicado, demonstramos que o tratamento diário, por via intraperitoneal, de camundongos BALB/c infectados por L. braziliensis com 20 mg/kg de 17-DMAG, um inibidor da Hsp90, reduziu a carga parasitária, o diâmetro da lesão e a produção de citocinas proinflamatórias, em comparação ao grupo não tratado. No entanto, os animais tratados apresentaram sinais de toxicidade após seis semanas. Assim, objetivamos produzir e caracterizar nanopartículas poliméricas (NP) de PLGA contendo o 17-DMAG, que permitirão a liberação controlada do fármaco, a redução da dose utilizada e, consequentemente, a diminuição dos efeitos colaterais. A princípio, NP foram produzidas por dois métodos de emulsão dupla (P1 e P2) e caracterizadas morfologicamente por microscopia eletrônica de transmissão (MET) e microscopia eletrônica de varredura (MEV), quanto ao tamanho, formato e aspecto de superfície. O tamanho médio, índice de polidispersão (PdI) e a carga de superfície (potencial zeta - ZP) foram mensurados por Dynamic Light Scattering (DLS), e a eficiência de encapsulamento (%EE) foi medida por cromatografia líquida de alta performance (HPLC). P1 e P2 produziram NP esféricas e de superfície lisa e as NP produzidas por P2 (NP2) apresentaram melhores características que NP1, como menor tamanho (305.5 nm vs 489 nm), menor PdI (0.129 vs 0.33), maior potencial zeta (-28,7 vs -34,4 mV) e maior %EE (15,04% vs 14,9% - análise por sobrenadante - e 17% vs 14.02% - análise por filtro/coluna). Depois, foi avaliada a influência da massa de PLGA (100 ou 200 mg) ou da concentração de PEG (2,5% ou 5%) no tamanho médio e %EE do 17-DMAG nas NP. 100 mg de PLGA produziu NP menores, comparadas àquelas preparadas com 200 mg [336.5 nm (Q1: 318.4; Q2: 349.6) vs 387.8 nm (Q1: 382.8; Q2: 396.7)] e o uso de 5% de PEG gerou NPs menores que o emprego de 2,5% [297.2 nm (Q1: 288.6; Q2:304.1) vs 336.5 nm (Q1: 318.4; Q2: 349.6)]. Também, foram avaliados os perfis de liberação do 17-DMAG das NP otimizadas (NP2-17-DMAG) e a captação de NP por macrófagos derivados de medula óssea (BMMØ). Os resultados mostraram que o 17-DMAG foi liberado continuamente das NP2-17-DMAG ao longo de 72 h. Além disso, foi observado que BMMØ são capazes de captar e manter NPs no citoplasma após 30 min, 1, 2, 4, 6, 24, 48 ou 72 h. Ademais, a citotoxicidade (CC50) de NP2-17-DMAG sobre BMMØ e a eficácia sobre amastigotas intracelulares de L. braziliensis (IC50) foram avaliadas, in vitro. O CC50 de NP2-17-DMAG foi 10,9 vezes menor que o valor de CC50 para o 17-DMAG em sua forma livre [0,294 µM (0,29 ± 0,08) vs 3,2 µM (3,2 ± 1,06), respectivamente]. O IC50 de NP2-17-DMAG foi 3,36 vezes maior que o valor de IC50 para o 17-DMAG em sua forma livre [26,01 nM (26,01 ± 13,59) vs 7,72 nM (Q1: 4,14; Q3: 10,35), respectivamente]. Juntos, os dados mostraram que o encapsulamento do 17-DMAG pelo protocolo NP2 otimizado nesses ensaios, em comparação com o composto livre, aumentou a toxicidade do 17-DMAG sobre BMM? e reduziu sua eficácia no controle da infecção de BMM? por L. braziliensis, in vitro. Para otimizar o efeito leishmanicida com baixa toxicidade, ensaios futuros envolverão a análise, por meio de DSC e FTIR, de possíveis alterações químicas nas NP2-17-DMAG, oriundas de interações entre a NP e o fármaco e buscar por meio de alteração de pH e adição de sais, promover um aumento da %EE do 17-DMAG em NPs.