Caracterização funcional da enzima modificadora de histona Lisina Demetilase 1 (SmLSD1) em esquistossômulos de Schistosoma mansoni e padronização de anticorpos para realização de ChIP-seqvoltar para a edição atual

A esquistossomose é uma doença endêmica negligenciada causada pelo parasito Schistosoma mansoni e que representa grande problema de saúde pública. A ineficácia dos programas de controle em áreas de baixa prevalência e a ausência de medicamentos alternativos de alta eficácia tornam imprescindível o desenvolvimento de uma nova droga anti-Schistosoma. Dada a complexidade do ciclo de vida do parasito, apresentando fases de vida livre e parasitárias, ocorrem importantes adaptações na biologia promovendo encontro e reconhecimento dos hospedeiros, e interações necessárias para o estabelecimento da infecção. Estas adaptações são coordenadas por regulação na expressão gênica incluindo regulações pós-transcricionais, sendo essas exemplificadas por modificações epigenéticas, podendo levar ao aumento de variabilidade fenotípica e influenciar no estabelecimento da doença. Modificações epigenéticas se dão por meio de metilação do DNA e RNA, alterações nas proteínas histonas que compactam o DNA e/ou mediação por RNAs não-codificantes. Enzimas modificadoras de histonas (HMEs) são responsáveis por executar alterações nas histonas de modo a causarem mudança na expressão do epigenótipo. Estudos do grupo de pesquisa em Helmintologia e Malacologia Médica (HMM) demonstraram que inibidores da enzima Lisina Demetilase 1 (SmLSD1) impedem a motilidade, suprimem a produção de ovos e afetam o tegumento e estruturas de organelas celulares de S. mansoni, culminando com a morte de esquistossômulos e vermes adultos. Além disso, o silenciamento de SmLSD1 por RNA de interferência (RNAi) em vermes adultos suprime a produção de ovos. Dada a importância da compreensão das bases moleculares do parasito para o estabelecimento e manutenção da infecção, este projeto busca entender a função da enzima SmLSD1 e os mecanismos de regulação da expressão pós-transcricional promovida por ela na fase larval intramamífero do verme, a fim de sugerir alvos terapêuticos mais específicos e elucidar formas de prevenção da infecção. Para isso, culturas de esquistossômulos serão monitoradas diariamente, por 7 dias, por microscopia para verificação de alterações fenotípicas decorrentes do silenciamento de Smlsd1. Durante este período, será realizada a análise dos níveis de transcritos de Smlsd1 por RT-qPCR. Após a confirmação do silenciamento, para a realização do ChIP-Seq, será feita a padronização dos anticorpos específicos, produzidos em coelhos e adquiridos comercialmente, por meio de ensaios de Western blot, buscando estudar as metilações nas histonas H3K4me1 e H3K4me2. Adicionalmente, será feita a verificação da presença de DNA contaminante por reação de PCR com iniciadores que amplificam o gene gapdh de coelho. Após a padronização dos anticorpos, será realizada a imunoprecipitação da cromatina. Na sequência, a cromatina imunoprecipitada será validada por ChIP-qPCR, buscando determinar se o DNA precipitado está enriquecido em sequências de DNA associadas à metilação alvo. Por fim, o DNA obtido será sequenciado na plataforma Illumina HiSeq 2500 e os dados serão analisados buscando desvendar os mecanismos de regulação da expressão pela enzima SmLSD1. Até o momento foi feita a reação de PCR convencional para a verificação da presença de DNA de coelho contaminante nos anticorpos H3K4me1 e H3K4me2. E, por meio da revelação no gel de agarose, não foi visualizada a presença de DNA contaminante. Por ensaios de Western blot, verificou-se que os anticorpos foram capazes de reconhecer os alvos H3K4me1 e H3K4me2 de forma específica. E, atualmente, está em andamento a fase de padronização do protocolo de imunoprecipitação da cromatina. Estão sendo testados diversos parâmetros, como: (1) a quantidade material necessária para as extrações; (2) método de lise dos parasitos; (3) diferentes temperaturas e tempos de digestão a fim de avaliar o melhor desempenho da digestão com a enzima MNase; e (4) métodos para a confirmação da extração da cromatina e padrão de digestão com a MNase.