Produção de soro policlonal e avaliação da expressão de proteínas estágio específicas de Leishmania spp.voltar para a edição atual

JUSTIFICATIVA E RELEVÂNCIA Este subprojeto faz parte de um projeto que tem como objetivo maior estudar o processo de síntese de proteínas, ou tradução, nos tripanosomatídeos, protozoários flagelados causadores de diferentes enfermidades de impacto, como as leishmanioses [1]. Estes parasitas se destacam por apresentarem uma série de características únicas em processos ligados à sua expressão gênica e mecanismos de regulação [2]. O foco da pesquisa é o estudo de complexos do tipo eIF4F de iniciação da tradução. Em outros eucariotos o complexo eIF4F tem como função principal o reconhecimento dos mRNAs eucarióticos, e seu recrutamento para a tradução [3]. A equipe responsável pelo projeto atuou na descrição em “Leishmania” de múltiplos homólogos de subunidades deste complexo, formando um mínimo de cinco complexos e indicando uma complexidade na tradução não observada em outros organismos [4]. Contudo a participação destes complexos em eventos ligados a diferenciação celular nestes patógenos, críticos para sua sobrevivência em diferentes hospedeiros e condições ambientais e para sua patogenicidade, ainda precisa ser melhor investigada. Neste projeto, soros policlonais, proteínas recombinantes e inúmeras construções gênicas vêm sendo utilizados, associados a ferramentas bioquímicas e de biologia molecular de ponta. Diferentes espécies de Leishmania (como L. infantum, L. amazonensis, L. tarentolae e L. braziliensis) são alvos do estudo, tendo em vista seu impacto na saúde pública do Brasil. Contudo, para se investigar processos de diferenciação celular, são necessárias linhagens passíveis de serem cultivadas em diferentes formas de vida, cuja diferenciação precisa ser monitorada de acordo com o padrão de expressão de marcadores proteicos estágio-específicos. Entretanto, existe uma lacuna de ferramentas disponíveis para se avaliar a expressão desses marcadores, como soros policlonais específicos. Este subprojeto almeja então apoiar o esforço de produção de soros capazes de avaliar a expressão de marcadores proteicos estágios específicos em diferentes espécies de Leishmania. O foco desse trabalho serão as proteínas HASP, preferencialmente, e SHERP, de duas ou mais espécies de Leishmania. [5] OBJETIVOS Geral Produzir soro policlonal específico e avaliar a expressão em “Escherichia coli” de antígenos expressos de forma estágio específica em espécies distintas de “Leishmania”. Específicos a) Amplificar e clonar, em vetores plasmidiais de expressão, genes codificantes da proteína HASP e/ou SHERP de ao menos duas espécies distintas de “Leishmania”, “L. braziliensis” e “L. amazonensis”. b) Expressar e purificar as respectivas proteínas recombinantes em “Escherichia coli” e realizar a sua purificação por cromatografia de afinidade; b) Produzir soros em coelho contra as proteínas recombinantes; c) Purificar os anticorpos obtidos, verificar a sua especificidade e avaliar a expressão das respectivas proteínas em fases diferentes de cultivo de diferentes espécies de “Leishmania”. METODOLOGIA Os DNAs codificantes das proteínas de interesses serão amplificados e clonados em vetores de clonagem e expressão. Em seguida será feita a transformação e expressão das proteínas recombinantes em E. coli. Será realizada a produção em larga escala da proteína recombinante e depois a purificação proteica através de resina Ni-NTA Agarose (Qiagen). Em seguida serão obtidos soros policlonais através da imunização de coelhos e anticorpos específicos purificados por imunoadsorção. Por fim, os anticorpos serão utilizados em ensaios de western blot contra as proteínas recombinantes e/ou extratos de parasitas. REFERÊNCIAS [1] LUKEŠ, J. et al. Trends in Parasitology, v. 34, n. 6, p. 466–480, jun. 2018. [2] CLAYTON, C. Open Biology, v. 9, n. 6, 2019. [3] MERRICK, W. C. Journal of Biological Chemistry, v. 290, n. 40, p. 24091–24099, 2015. [4] FREIRE, E. et al. Pathogens, v. 6, n. 4, p. 55, 2017. [5] SÁDLOVÁ, J. et al. Cellular Microbiology, v. 12, n. 12, p. 1765–1779, dez. 2010.