Identificação e validação in vitro de novos alvos terapêuticos para leucemia linfoide aguda de células Tvoltar para a edição atual

A leucemia linfoide aguda de células T (LLA-T) representa de 12% a 15% de todos os casos de LLA em crianças e 25% em adultos, sendo que 20% dos pacientes entram em recidiva dentro de 2 anos após o diagnóstico. A doença recorrente é muito difícil de ser curada. Nesta fase, o transplante de medula óssea é o único tratamento que pode levar à cura, mas a reintrodução da remissão é um pré-requisito e isso é um desafio. O presente projeto propõe a identificação de alvos terapêuticos através de uma nova abordagem onde os genes alvos serão identificados pela análise combinada do interatoma e transcriptoma humanos (Carels et al., 2015). É esperado que a inibição de proteínas de alta conectividade e superexpressas em células malignas promova maior desarticulação nas redes de sinalização e as encaminhem para morte celular com menor incidência de efeitos colaterais para os tecidos saudáveis. Portanto, os novos alvos a serem identificados vão representar proteínas superexpressas e com maior grau de conectividade. O objetivo geral desse projeto é identificar novos alvos terapêuticos para LLA-T e validar in vitro os 5 mais promissores. Objetivos específicos: 1) Quantificação dos transcritos a partir dos dados de RNA-seq disponíveis nos bancos de dados. Iremos analisar os dados de RNA-seq de linhagens celulares de LLA-T, pacientes e células T e timócitos não leucêmicos (controles). O perfil de expressão gênica será avaliado por meio da taxa de identidade das sequências (tags) de RNA-seq com o conjunto das sequências humanas (BLASTn). A contagem de tag por gene será normalizada de acordo com os métodos descritos por Mortazavi et al. (2008) e Bullard et al. (2010). Os valores de expressão (contagem dos tags após normalização) da célula maligna serão subtraídos dos valores de expressão do controle. Os valores positivos indicam aumento do nível de expressão nas células tumorais. Para selecionar os genes superexpressos, utilizaremos como limiar um intervalo de confiança de 99%, considerando uma classificação one tail na base da distribuição gaussiana. 2) Escolha das proteínas com maior grau de conectividade nos subinteratomas de genes regulados positivamente como sendo alvos terapêuticos Com a lista dos genes regulados positivamente iremos identificar o sub-interatoma correspondente por comparação com o interatoma da EBI. A associação dos dados de transcriptoma e de interatoma permitirá identificar as proteínas reguladas positivamente que apresentam o maior potencial de se conectar com outras (hubs). As 5 proteínas com maior potencial de conexões reguladas positivamente serão consideradas como alvos para os testes de validação in vitro. 3) Knockdown dos alvos pela técnica de RNAi e/ou Knockout por Crisper/CAS9. Para a validação dos genes, usaremos linhagens celulares derivadas de LLA-T e, como controle, linfócitos do sangue periférico de doadores não portadores de leucemia para avaliarmos o efeito do knockdown/knockout dos genes. O knockdown dos alvos será feito pela técnica de RNAi. Moléculas de shRNA específicas para os genes identificados nos objetivos 1 e 2 serão adquiridas comercialmente e as linhagens celulares derivadas de LLA-T assim como os linfócitos controle, serão transduzidas os vetores contendo os shRNA de forma individual ou em conjunto. Alternativamente, o knockout dos genes poderá ser feito via Crisper/CAS9. Posteriormente a proliferação, viabilidade e apoptose serão avaliados. 4) Avalição da viabilidade e proliferação celular: Realizaremos contagem das células usando azul de tripan para verificar a proliferação celular e ensaios de cristal violeta e MTT (brometo de 3-(4,5-dimetil tiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólio) para detectar a viabilidade das células. A apoptose será avaliada por citometria de fluxo, através da marcação das células com anexina V e iodeto de propídeo. Carels N et al., 2015. PLoS One 10(1):e0115054 Mortazavi A et al., 2008. Nat Methods. 5:621–628 Bullard JH et al., 2010. BMC Bioinformatics. 18:11-94.