Avaliação do Desempenho do Método Sorológico Chagas-Flow ATE por Citometria de Fluxo para a Monitoração Pós-tratamento da Doença de Chagasvoltar para a edição atual

1. JUSTIFICATIVA E RELEVÂNCIA DO PROJETO Durante o Segundo Consenso Taxonômico do T. cruzi, o parasito foi classificado em seis grupos genéticos distintos, “Discrete Typing Unitys” (DTUs), de TcI a TcVI (Zingales et al., 2009). Diversos trabalhos vêm associando a genética do T. cruzi com as características biológicas do parasito, com as manifestações clínicas da doença de Chagas e com a eficácia terapêutica do tratamento na infecção pelo T. cruzi (Toledo et al., 2003; Valadares et al., 2007; Zingales et al., 2012). Diante desse contexto, torna-se cada vez mais importante associar a diversidade genética do parasito com as técnicas utilizadas para o diagnóstico da doença de Chagas. Os métodos moleculares são os mais utilizados no diagnóstico genótipo-específico da DCh, no entanto apresentam limitações, tais como: necessidade de um conjunto de marcadores genéticos, principalmente para a identificação de infecções mistas, necessidade do isolamento prévio do parasito por métodos de baixa sensibilidade e possível seleção clonal do parasito (D´Ávilla et al., 2009; Zingales et al., 2012). Já os métodos sorológicos empregados no diagnóstico genótipo-específico da DCh não foram capazes de reconhecer todas as DTUs do T. cruzi presentes nos hospedeiros (Bhattacharyya et al., 2014). Nesse contexto, foi desenvolvida a técnica sorológica por citometria de fluxo para a pesquisa de IgG1 anti-amastigota (A), tripomastigota (T) e epimastigota (E) do T. cruzi, denominada Chagas-Flow ATE (Alessio et al., 2014, Patente BR 102014003374-2). Inicialmente, a Chagas-Flow ATE foi desenvolvida para o diagnóstico genótipo-específico da infecção experimental pelo T. cruzi, apresentando um bom desempenho para discriminar as diferentes DTUs do parasito que infectavam os camundongos. (Alessio et al., 2017, 2018). Recentemente, utilizando amostras de soros de humanos, foi demonstrado que a Chagas-Flow ATE apresentou uma excelente acurácia (100%) no diagnóstico universal e genótipo-específico da DCh para discriminar as infecções pelas DTUs “TcI x TcVI x TcII” (92%) e “TcI x TcII” (97%) (Alessio et al., 2020). Tendo em vista que hospedeiros infectados por diferentes DTUs do T. cruzi apresentam uma susceptibilidade distinta ao tratamento etiológico da DCh, a validação e completo desenvolvimento da Chagas-Flow ATE será de extrema importância em estudos futuros de monitoração pós-terapêutica em pacientes portadores da doença de Chagas. 3. OBJETIVO GERAL Avaliar o desempenho da técnica Chagas-Flow ATE na monitoração pós-tratamento da doença de Chagas. 3.1. Objetivos específicos 1- Avaliar a reatividade de amostras de soros de pacientes infectados com diferentes DTUs do T. cruzi antes e 10 anos após o tratamento, por meio da técnica Chagas-Flow ATE. 2- Avaliar o desempenho dessa nova metodologia por meio de análises estatísticas. 4. METODOLOGIA O procedimento experimental da Chagas-Flow ATE será realizado como descrito previamente por Alessio et al. (2020). Esse projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética do Instituto René Rachou/Fiocruz MG (C.A.A.E: 26890014.6.0000.5091, número do protocolo #3.055.734). A metodologia será realizada nas seguintes etapas: 1) Seleção dos soros que serão testados na Chagas-Flow ATE. Serão utilizadas 60 amostras de soros, sendo 30 de pacientes infectados com TcI e 30 com TcII, antes do tratamento e 10 anos após o tratamento, de ambos os sexos, com idade acima de 18 anos. Serão testadas 20 amostras de soros de indivíduos não infectados pelo T. cruzi. As amostras de soros já foram coletadas e se encontram armazenadas à -80°C. 2) Cultivo e preparação das formas amastigotas (AMA) + tripomastigotas (TRIPO) em cultura de células L929, e de epimastigotas (EPI) do T. cruzi em meio acelular “Liver Infusion Tryptose” (LIT). A suspensão de EPI será fixada com solução fixadora para citometria de fluxo (MFF). Serão cultivados as três formas evolutivas do parasito das DTUs TcI (cepa Colombiana) e TcII (cepa Y) para serem utilizadas como antígeno na Chagas-Flow ATE. As formas tripomastigotas e amastigotas não serão cultivadas pela bolsista. 3) Realização da sorologia Chagas-Flow ATE e leitura na citômetro de fluxo FACScalibur. As formas amastigotas e tripomastigotas vivas e epimastigotas fixadas dos diferentes genótipos serão marcadas com isotiocianato de fluoresceína (FITC). Após a marcação essas formas evolutivas serão misturas em proporções equivalentes. Em placas de 96 poços de fundo em U, os soros diluídos (1:1000 a 1:32.000) serão incubados com os antígenos AMA/TRIPO/EPI a 37°C por 30 min. Posteriormente, será realizada a incubação com o anticorpo humano anti-IgG1 biotinilado junto com a estreptoavidina conjugada com a ficoeritrina a 37°C por 30 min. No final do experimento, os parasitos serão fixados com de MFF e será realizada a leitura no citômetro de fluxo FACScalibur. O bolsista irá acompanhar os experimentos e auxiliar nas etapas que não envolvam a manipulação das formas tripomastigotas e amastigotas vivas do T. cruzi. 4) Realização das análises no “FlowJo” e de análises estatísticas no “Graph Pad Prism”.