Desenvolvimento de vacina bloqueadora de transmissão como método alternativo para o controle da leishmaniose visceralvoltar para a edição atual

As leishmanioses acometm mais de 1,5 milhão de pessoas anualmente. A Leishmaniose Visceral (LV) é a forma mais agressiva, e, se não tratada, pode levar a óbito em mais de 95% dos casos. No combate às doenças veiculadas por insetos, uma das principais abordagens é o controle dos vetores, realizado principalmente com o uso de inseticidas, método este dispendioso e ineficaz. As vacinas bloqueadoras de Transmissão (VBTs) são uma abordagem alternativa visando o controle de patógenos transmitido por Artrópodes. VBTs visam interferir no desenvolvimento de patógenos dentro do vetor, interrompendo sua transmissão para hospedeiros vertebrados. VBTs tem obtido sucesso no combate à malária e tem sido proposta em estudos contra leishmanioses. A identificação de alvos para o desenvolvimento de VBTs é o primeiro passo do processo, e depende de um bom conhecimento das interações moleculares entre parasita e vetor. O processo de interação entre Leishmania e seu vetor vem sendo estudado pelo Laboratório de Biologia Molecular de Parasitas e Vetores. Nosso grupo identificou genes de Leishmania com expressão modulada dentro do inseto que podem estar envolvidos no sucesso da infecção do parasito no vetor. Dentro deste repertório, há genes relacionados à diferenciação e proliferação do parasita. Além disso, recebemos de colaboradores, cepas de Leishmania mutantes para outros genes de interesse, principalmente relacionados à aquisição e metabolismo do ferro, como o transportador de ferro LIT1, e já temos resultados animadores usando esse alvo. Objetivos gerais e específicos O objetivo deste projeto é utilizar moléculas presentes em L. i chagasi como alvo para o desenvolvimento de VBTs contra LV. Dentre estas, foram incluídas proteínas relacionadas à aquisição e metabolismo do ferro, como o transportador de ferro LIT1 e uma ferro redutase (LFR1) de Leishmania (Flannery et al., 2011), bem como proteínas que atuam no metabolismo de grupamento heme (LHR1) e íons ferro (LIR1). Objetivos: 1. Imunizantes (peptídeos sintéticos) serão inoculados em animais (camundongos e hamsters) para a produção de anticorpos e posteriormente será coletado sangue para teste de imunogenicidade. 2. Anticorpos serão purificados a partir do soro coletado e utilizados em infecções artificias de L. longipalpis por L. i chagasi e será avaliada a carga parasitária no inseto. Soro pré-imune será utilizado como controle. Metodologia Síntese de peptídeos sintéticos Peptídeos sintéticos estão sendo adquiridos. Já possuímos peptídeos sintéticos para quatro alvos. Estamos também trabalhando na identificação e validação de outros alvos. Inoculação dos imunizantes em animais para a produção do antissoro Anticorpos policlonais serão obtidos a partir da inoculação dos peptídeos sintéticos em camundongos e hamsters em 3 doses, emulsionados em adjuvante recomendado. Sangue dos animais será coletado e a presença dos anticorpos será investigada no soro, por ELISA. Esta metodologia será executada em colaboração com o pesquisador Eduardo Fonseca Pinto (Laboratório Interdisciplinar de Pesquisas Médicas, Instituto Oswaldo Cruz), com grande experiência em vacinação contra leishmaniose em modelo murino e hamster. Infecções artificias de L. longipalpis por L. i. chagasi e avaliação da infecção Serão utilizados insetos provenientes de nossa colônia de L. longipalpis, originalmente coletadas em Jacobina (Bahia, Brasil), mantidos a 26°C. L. i. chagasi são mantidas rotineiramente em nosso laboratório em meio 199 (pH7.0) suplementado com soro fetal bovino, a 26°C. Anticorpos de interesse purificados e hemácias serão reincorporadas ao soro previamente inativado por calor para inativação do sistema complemento. A este sangue reconstituído serão acrescidos 107 parasitos/ml, para a alimentação artificial de fêmeas de L. longipalpis. O controle experimental será realizado com soro pré-imune. Nos horários pós-infecção de 1h, 24h, 48h, 72h, 96h, 144h e/ou 168h, um pool de 10 insetos será coletado e armazenado em Trizol (Invitrogen) para posterior extração de RNA e síntese de cDNA, a partir do Kit SuperScript III First-Strand Synthesis Kit (Invitrogen). A carga parasitária será investigada pela quantificação do gene actina de Leishmania, normalizado pelo gene constitutivo GAPDH de L. longipalpis. A análise dos dados será pelo método comparativo ??Ct. Os experimentos serão feitos em triplicatas biológicas.