Investigação de Mecanismos Regulatórios do Sistema CRISPR/Cas em Isolados Clínicos de Pseudomonas aeruginosavoltar para a edição atual

O sistema CRISPR/Cas corresponde a um mecanismo adaptativo de defesa encontrado em arqueas e bactérias, formado por dois elementos principais: o locus CRISPR e as proteínas Cas. O locus CRISPR é composto por sequências repetidas interespaçadas por espaçadores provenientes de elementos genéticos móveis. Para o funcionamento desse sistema, são necessárias três etapas principais: adaptação, onde ocorre o primeiro contato com o DNA exógeno e incorporação do espaçador no locus CRISPR; expressão, etapa em que ocorrem a transcrição e tradução de proteínas Cas; e a interferência, etapa em que ocorre o reconhecimento e degradação de moléculas de DNA invasoras. Pseudomonas aeruginosa é um patógeno oportunista, associado principalmente a infecções hospitalares, com alta capacidade de adquirir mecanismos de resistência a antimicrobianos e produzir biofilme. Como infecções por P. aeruginosa são frequentemente resistentes a várias classes de antimicrobianos usados na clínica, e pela dificuldade de fármacos penetrarem na matriz polimérica do biofilme, tem-se buscado desenvolver estratégias alternativas para o combate deste microrganismo, como o uso de fagoterapia. Sistemas CRISPR/Cas do tipo I, subtipos F e E, foram encontrados em estudos prévios do grupo de pesquisa. A funcionalidade e regulação desse sistema nesta espécie ainda não é bem esclarecida. Diante do exposto, os resultados obtidos permitirão compreender os diferentes mecanismos dos sistemas CRISPR/Cas utilizados por este microrganismo, e auxiliarão na compreensão da possível interferência da maquinaria na multirresistência bacteriana. O projeto tem como objetivo geral investigar mecanismos regulatórios do sistema CRISPR/Cas em isolados clínicos de P. aeruginosa. Os objetivos específicos são avaliar quantitativamente a expressão de genes relacionados aos sistemas CRISPR/Cas, Quorum Sensing e genes de ativação de biofilme KinB/AlgB de forma constitutiva e após deleção do Sistema CRISPR/Cas, em isolados sob condições de migração. Para isso, serão utilizados dois isolados clínicos de P. aeruginosa CRISPR/Cas positivos, representativos dos subtipos I-F e I-E. O experimento de migração bacteriana será realizado de acordo com Chabas et al. (2016), no qual os dois isolados serão inoculados em meio mínimo M9 suplementado com 0,2% de glicose, junto com um plasmídio contendo uma sequência espaçadora presente nos isolados clínicos em estudo. Paralelamente, o mesmo isolado será incubado no mesmo meio, porém sem o plasmídio. Durante cinco dias as culturas serão transferidas para um novo meio simulando uma baixa ou alta taxa de migração. Ao final do experimento as culturas serão submetidas à técnica de qPCR (Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR). Para realizar a análise quantitativa da expressão gênica serão investigados os genes cas1f e csy1 (subtipo I-F), e cas1e e cse4 (subtipo I-E). Os genes algB e amrZ serão utilizados na investigação da produção de biofilme, e os genes lasI, lasR, rhlI e rhlR serão utilizados para avaliar o mecanismo de Quorum sensing. Como controle endógeno da reação, será utilizado o gene constitutivo rpsL de P. aeruginosa.