Desenvolvimento e padronização de um ensaio in vitro para avaliação de compostos com atividade inibitória da fosfatase TcALPH1 de Trypanosoma cruzi.voltar para a edição atual

A doença de Chagas (DC) é endêmica em 21 países da América Latina e do Caribe, sendo que cerca de 7 milhões de pessoas estão infectadas e mais de 10 mil morrem todos os anos. Em sua maioria, são pessoas pobres, constituindo assim um mercado pouco atrativo para a indústria farmacêutica privada. Sem diagnóstico e tratamento adequados, um em cada três pacientes irá desenvolver a forma fatal da DC, com o acometimento do coração. Segundo a OMS, o número de casos diagnosticados vem crescendo nos últimos anos devido à migração populacional e à inclusão de novas áreas de transmissão até então não endêmicas. Para o tratamento dos pacientes com DC existem duas drogas preconizados, o benznidazol e o nifurtimox mas com eficiência muito limitada à fase aguda da doença. Cerca de menos de 1 % dos pacientes têm acesso aos medicamentos, que são distribuídos pelas entidades sanitárias nacionais, sob coordenação da OPAS. Somado à baixa disponibilidade, há a ocorrência de efeitos adversos graves, como dores musculares, intolerância gástrica, anorexia, erupções cutâneas entre outros. Esses efeitos colaterais fazem com que 2 em cada 10 pacientes não terminem o tratamento, que tem duração de 60 dias. Cepas resistentes a esses dois medicamentos têm sido descritas desde a década de 80; além do fato de não serem eficazes na fase crônica tardia da DC, momento em que a maioria dos casos é diagnosticado. Frente a todas essas limitações relacionadas ao tratamento, se faz necessário com urgência o desenvolvimento de novas alternativas que sejam mais eficientes para o combate à DC. Deve-se buscar tratamentos que não só eliminem o patógeno na fase crônica da doença, mas que sejam menos tóxicos, contribuindo para melhorar a qualidade de vida do paciente. Neste sentido esta proposta tem como foco desenvolver e padronizar um teste enzimático in vitro para avaliar a atividade inibitória de compostos contra a proteína ALHP1 de T. cruzi. Dado que ALPH1 é uma fosfatase envolvida diretamente no controle da estabilidade dos mRNAs em tripanosomatídeos, que este controle é imprescindível para a regulação da expressão gênica nestes organismos, que a deleção da proteína é letal para o parasita e, ainda, que tal proteína não apresenta homologia com proteínas de mamíferos, ALPH1 representa um alvo (espécie-específico) potencial para novos tratamentos, mais eficazes e menos agressivos contra a DC. É válido ressaltar que dispomos em nosso laboratório de cerca de 6 mil compostos distribuídos em 3 coleções para pronto uso. Assim, após a padronização do teste in vitro, estes compostos serão triados quanto sua capacidade inibitória da fosfatase. A busca em coleções de compostos já regulamentados e aplicados na medicina humana adentra no campo do reposicionamento de fármacos, uma importante área da pesquisa que é responsável por expressivo avanço no tratamento de diversas doenças e condições. Com o estabelecimento de um ensaio efetivo e sensível para a avaliação da atividade de fosfatase da ALPH1 teremos a validação de uma importante ferramenta para uma varredura preliminar e rápida de compostos com potencial efeito anti-tripanocida, com um direcionamento do provável mecanismo de ação da droga em questão. Para alcançar tal objetivo, o domínio funcional da ALPH1 será expresso, purificado e utilizado na padronização do teste colorimétrico. Para este propósito serão realizados testes e padronizações baseadas nos ensaios enzimáticos já descritos na literatura ou por meio da aplicação de ensaios disponíveis em testes comerciais.de atividade de fosfatase in vitro. Por fim, através da aplicação do ensaio de atividade de fosfatase será realizada a avaliação dos diferentes compostos, previamente selecionados presentes nas três coleções disponíveis no laboratório. Esperamos, com este projeto, poder contribuir para a identificação de novas drogas, potencialmente mais eficientes e menos tóxicas para o tratamento da DC.