Ensaio citofluorimétrico para caracterização fenotípica das células envolvidas nas respostas do tipo Th1 e regulatória de camundongos imunocompetentes e imunossuprimidos infectados com espécies do complexo Sporothrix.voltar para a edição atual

PROJETO Ensaio citofluorimétrico para caracterização fenotípica das células envolvidas nas respostas do tipo Th1 e regulatória de camundongos imunocompetentes e imunossuprimidos infectados com espécies do complexo Sporothrix. Orientadores Orientadora: Danielly Corrêa Moreira de Sequeira Co-orientador: Manoel Marques Evangelista de Oliveira Palavras-chave: Sporothrix, esporotricose, relação parasito-hospedeiro, resposta imune, modelo murino 1. Introdução e justificativa Sporothrix schenckii é um fungo dimórfico, que pertence à Divisão Ascomycota, Classe Pyrenomycetes, Ordem Ophiostomatales, Família Ophiostomataceae (Marimom et al, 2006), cuja fase micelial, saprófita, é obtida também em cultura a 25ºC e sua fase leveduriforme, parasitária, é obtida em meio BHI (Brain Heart Infusion), em temperaturas que variam entre 35°-37°C. Até 2006, S. schenckii era considerada a única espécie patogênica, entretanto, estudos filogenéticos demonstraram uma variabilidade genética entre as espécies de S. schenckii (Marimon et al., 2006; de Meyer et al., 2008 ), atualmente considerada um complexo de espécies, inicialmente composto por S. schenckii sensu stricto, S. brasiliensis, S. globosa, S. luriei, S.mexicana, S.pallida e S. chilensis todas consideradas patogênicas (Marimon et al., 2007, 2008; 2009; Dias et al., 2011; Morrison et al., 2013; Cruz-Choappa et al., 2014; Rodrigues et al., 2016). Na imunopatogênese das infecções fúngicas, as células T regulatórias (Tregs), são responsáveis por manter a homeostase por diversos mecanismos, como por exemplo, a supressão dos efeitos deletérios de células Th2 (Wiesner et al., 2016) e da ação de neutrófilos por meio da ação combinada de IL-10 e CTLA-4 (Montagnolli et al., 2006). Com base no exposto, nos propomos a avaliar a geração de células T regulatórias em camundongos imunocompetentes e imunossuprimidos infectados com as espécies S. schenkii stricto sensu e S. brasiliensis, isolados de uma área de epidemia de grande impacto como o Rio de Janeiro, com o objetivo de ampliar o conhecimento sobre mecanismos imunológicos envolvidos na resposta contra essas duas espécies. Sendo assim, a justificativa desse trabalho se baseia no escasso conhecimento sobre as bases celulares e imunológicas da interação de Sporothrix com os hospedeiros. Os registros na literatura são relatos de casos clínicos, sem aprofundamento do entendimento da interação parasito-hospedeiro. Os trabalhos experimentais utilizando modelos murinos, estudaram a virulência dessa espécie e o estabelecimento da doença em hospedeiros imunocompetentes e imunossuprimidos, sem aprofundar a resposta imunológica. 2. Objetivo Analisar a resposta à infecção, in vivo, de camundongos C57BL/6, imunocompetentes e imunossuprimidos, frente a conídios de Sporothrix spp., por meio de citometria de fluxo dos linfócitos T destes animais. 3. Metodologia Citometria de fluxo: Esplenócitos serão recuperados dos baços coletados durante as necropsias dos animais (grupo I a IV), para análise por citometria de fluxo. As hemácias serão lisadas a partir da adição de tampão de lise por baço. Após, serão realizadas 3 lavagens consecutivas com tampão de coloração gelado e transferidas para os tubos FACS, centrifugadas , e descartado o sobrenadante. Ao pellet serão adicionados anticorpos monoclonais marcados com fluorocromos (CD4, CD8, FoxP3), na tentativa de verificar a expressão dos marcadores de superfície para os subtipos de células T. Após incubação, as células serão lavadas com tampão de coloração e fixadas por incubação com paraformaldeído. Posteriormente, serão transferidas para mini-tubos e estocadas até o momento da aquisição no citômetro de fluxo MoFlo. Para análise dos dados obtidos, será utilizado o software FlowJo.