Avaliação da sinalização por GDF11 durante a regeneração do músculo esqueléticovoltar para a edição atual

A utilização de células-tronco para o tratamento de lesões ou doenças degenerativas esbarra em diversos desafios, como a reprodutibilidade em ensaios clínicos. De fato, a capacidade regenerativa das células-tronco adultas depende do microambiente local, que pode direcionar o processo de regeneração à deposição exacerbada de matriz extracelular e culminar em disfunção tecidual. No músculo, células-tronco denominadas de células satélites ficam localizadas entre a membrana da fibra muscular e a membrana basal que envolve essa estrutura. Elas ficam em estado de quiescência, podendo ser ativadas após lesão ou trauma. Parte delas volta a apresentar características estaminais (autorrenovação), enquanto a outra parte (denominada de mioblastos) prolifera e pode se diferenciar para formar novas fibras musculares ou recuperar as fibras danificadas. Nesse contexto, os macrófagos, através de citocinas liberadas exercem um papel central para o sucesso regenerativo. O GDF11 faz parte da família do TGF-?, e dois membros dessa família, TGF-? e Miostatina (GDF8), tem papel fundamental, e bem documentado, na regeneração muscular esquelética, tanto em situações fisiológicas quanto patológicas1. Foi sugerido que GDF11 poderia atuar como uma molécula rejuvenescedora, sendo capaz de reverter a hipertrofia cardíaca relacionada à idade2, além de restaurar a integridade genômica das células satélites envelhecidas no músculo esquelético3. Porém, estudos mais recentes mostram um papel controverso de GDF11, que poderia prejudicar a regeneração muscular e causar um aumento significativo do conteúdo de colágeno no músculo4,5,6. Nossos resultados mostram que GDF11 inibe a diferenciação e fusão de mioblastos humanos, mas é capaz de estimular a proliferação dos mioblastos. Nosso grupo demonstrou que estimular a proliferação, consequentemente retardando a diferenciação, melhorava a capacidade regenerativa de células progenitoras musculares humanas (mioblastos) transplantados em camundongos imunodeficientes7. Um dos objetivos do projeto principal é desenvolver um peptídeo otimizado de GDF11 que poderia promover uma melhor regeneração muscular, ao por exemplo, estimular a proliferação sem prejudicar a capacidade de fusão dos mioblastos. Nesse contexto é importante identificar quais células produzem GDF11 e expressam seus receptores, e que tipo de resposta celular ocorre dessa interação. Objetivos: 1) Identificar a expressão de GDF11 e seus receptores (ALK4, 5 e 7) em músculos de camundongos após lesão muscular; 2) Realizar o screening de mioblastos nocautes para ALK5 (ALK4 e 5 realizados), e analisar a proliferação, diferenciação e fusão do clone selecionado Metodologia: Imunofluorescência: músculos tibialis anterior (TA) de camundongos C57BL/10 lesionados por cardiotoxina foram coletados e parte processados com as lâminas armazenadas. Nos pontos da cinética de 24h, 72h, 5, 10 e 21 identificaremos por imunofluorescência a expressão de GDF11 e seu receptores em macrófagos, células satélites, mioblastos e fibras musculares. Screening de mioblastos (CL25) nocautes para ALK5 (ALK5-KO): Nós produzimos os vetores de expressão CRISPR/Cas9, eletroporamos, fizemos o enriquecimento das células GFP positivas e as colocamos em diluição limitante para selecionarmos os clones. A avaliação da especificidade e a eficiência da clivagem dos clones selecionados será realizada por PCR e posterior sequenciamento para confirmação e caracterização das alterações indels (inserções/deleções). Avaliação da proliferação e diferenciação do clone mutante para ALK5: mioblastos humanos da linhagem CL25, mutantes e WT serão cultivados em meio de proliferação ou diferenciação. Ensaios de incorporação de EdU e contagem celular avaliarão a proliferação, enquanto a diferenciação será avaliada pelo índice de fusão e quantificação do número e espessura dos miotubos, bem como o número de núcleos por fibra muscular revelados por DAPI e imunomarcação contra miogenina e cadeia pesada de miosina.