Novas abordagens moleculares em Trypanosoma cruzi para estudos sobre a progressão e tratamento da doença de Chagas.voltar para a edição atual

A doença de Chagas é considerada negligenciada, e o benznidazol é a única droga usada no tratamento, causa sérios efeitos colaterais e possui baixa eficácia. Na busca de novos compostos e esquemas terapêuticos são necessários vários testes in vitro e in vivo, entretanto, é fundamental que sejam desenvolvidos métodos rápidos e reprodutíveis de avaliação de compostos, reduzindo os viéses metodológicos relacionados com a contagem de células. Com esse objetivo produzimos cepas de T. cruzi Dm28 geneticamente modificadas (GM), expressando a enzima luciferase (Dm28-Luc) e a proteína fluorescente EGFP (Dm28-EGFP), ferramentas importantes para padronização de novos métodos de análise utilizando novas tecnologias. Primeiramente foram realizados ensaios de padronização do modelo, em linhagem de células LLC-MK2 infectadas com T. cruzi cepa Dm28 GM, para os testes in vitro. Foram determinadas, a quantidade ideal de células LLC-MK2, e as condições de cultivo. As cepas Dm28-Luc, Dm28-EGFP, foram capazes de infectar as células LLC-MK2 e de manter a infecção com o aumento do número médio de amastigotas intracelulares ao longo do tempo, em comparação com a cepa selvagem (Dm28-WT). Utilizando o posaconazol como curva padrão das avaliações dose-resposta, o IC50 para as amastigotas intracelulares em células LLC-MK2 infectadas com T. cruzi cepa Dm28-WT, foi estimado em 1,25 nM por contagem em microscópio óptico e cálculo do índice de infecção. Curvas dose-resposta com posaconazol em leitor de microplaca (luminômetro/flourímetro) para estimar o IC50 em amastigotas intracelulares de LLC-MK2 infectadas com T. cruzi GM (Dm28-Luc, Dm28-EGFP) produziram valores de IC50 próximos dos valores estimados por contagem, 1,9 e 1,5 nM para amastigotas de Dm28-Luc e para Dm28-EGFP, respectivamente. Amastigotas da cepa Dm28-EGFP em células LLC-MK2 podem ser de grande auxílio na triagem de compostos pelo leitor de microplaca, assim como para avaliações automatizadas pelo sistema de análise de alto conteúdo (HCS), permitindo o cálculo do índice de infecção e do IC50. As imagens das células e protozoários fluorescentes adquiridas com os filtros FITC, DAPI e Cy3 pela plataforma automatizada de microscópia de fluorescência ImageXpress Micro confocal, e em seguida análisadas de forma automatizada em pipeline customizado pelo software CellProfiler. Pelo método automatizado, em amastigotas de células LLC-MK2 infectadas com Dm28-EGFP o IC50 para posaconazol foi estimado em 1,84 nM, semelhante ao encontrado anteriormente pelos outros métodos. Portanto, as metodologias de avaliação de compostos em amastigotas intracelulares de LLC-MK2 infectadas com T. cruzi GM, pelo leitor de microplaca e pelo sistema automatizado HCS, se mostraram apropriadas. O nosso objetivo é de avaliar a atividade de extratos de plantas Piper amalago e Piper glabratum pelo sistema de análise de alto conteúdo (HCS) e leitor de microplaca, utilizando as cepas de T. cruzi geneticamente modificadas, Dm28-EGFP e Dm28-Luc.