Iniciativa Brasileira de Reprodutibilidade: medindo quão reprodutível é a ciência biomédica no Brasilvoltar para a edição atual

Nas últimas décadas tornou-se claro que as práticas comuns experimentais, juntamente com um sistema de publicação que recompensa a produtividade em vez do rigor, pode nos levar a uma literatura científica que carece de confiabilidade. Nesse contexto surgiu a Iniciativa Brasileira de Reprodutibilidade (IBR), um esforço multicêntrico, cujo desafio é avaliar a reprodutibilidade da ciência biomédica brasileira. O objetivo da IBR é replicar de 50 a 100 experimentos de artigos brasileiros, dentro de uma rede nacional de colaboradores. Nosso grupo de pesquisa “Biotecnologia Aplicada ao Estudo de Patógenos” (BAP) foi selecionado para fazer parte desse projeto coordenado pela UFRJ e pelo Instituto Serrapilheira. A importância destas iniciativas de replicação tem sido demonstrada em inúmeras áreas de pesquisa. A ciência brasileira cresceu rapidamente nas últimas décadas sob pressão para aderir a padrões das agências de fomento públicas, criando um terreno abundante para fatores considerados implícitos à falta de reprodutibilidade, como uma mentalidade publicitária que incentiva o baixo rigor metodológico e científico. Os resultados não só serão fundamentais para avaliar o quão reprodutível é a ciência biomédica brasileira, como podem ativamente contribuir para diminuir o desperdício futuro de vidas animais e materiais caros em experimentos irreprodutíveis. Ao final deste estudo, nosso grupo fará parte do primeiro estudo sistemático de reprodutibilidade científica a nível nacional. 3) Objetivo Geral Reproduzir cinco experimentos de artigos brasileiros pré-selecionados pela IBR que envolvem a avaliação da toxicidade celular por agentes químicos em macrófagos murinos e medir a expressão diferencial de genes na presença de cafeína e estradiol 3.1 Objetivos específicos - Analisar a viabilidade celular, proliferação e citotoxicidade dos agentes: (+)alfa-pineno; clorexidina e de uma mistura de pesticidas organoclorados; - Avaliar a expressão relativa do gene Slc2a4 na linhagem celular de adipócitos diferenciados 3T3-L1, na presença de 17-beta estradiol; - Quantificar a expressão relativa do gene Nr1i3 em hepatócitos de camundongo C57Bl/6 que receberam cafeína por via oral 4) Metodologia 4.1. Ensaio de MTT Camundongos Swiss entre 42-56 dias de idade, serão submetidos à extração de macrófagos peritoneais, elicitados mediante injeção IP de 1 mL de tioglicolato a 3 %. Três dias após a injeção, os camundongos serão anestesiados com 80 mg/kg de cetamina e 10 mg/kg de xilazina e serão eutanasiados. As células peritoneais elicitadas serão obtidas pela lavagem da cavidade peritoneal com PBS. A viabilidade celular será acessada utilizando Azul de Tripan (4 %). Os macrófagos serão expostos aos agentes: clorexidina, (+)-alfa-pineno e a uma mistura de pesticidas organoclorados, em tempos que variam de 1 a 48 h. Depois desse intervalo será adicionado o MTT às culturas, cujo metabolização resulta em cristais de formazan (azul), diretamente proporcional à viabilidade celular. Os cristais são solubilizados na presença de DMSO e a avaliação colorimétrica permite medir a viabilidade das células. 4.2. Ensaio RT-PCR: Camundongos C57Bl/6 fêmeas com três meses de idade e pesando 22-26 g receberão ou não (grupo controle) cafeína por via oral. A cafeína será diluída em água filtrada e os animais receberão 50 mg/kg por gavagem uma vez ao dia durante 15 dias. Os controles receberam apenas água filtrada. A solução estoque de cafeína a 20 mg/mL será armazenada em temperatura ambiente. O volume de cafeína administrado para cada animal será de 0,2 mL. No 16º dia os serão eutanasiados por anestesia profunda (Thiopental 250 mg/kg). Os fígados serão colhidos para extração de mRNA, congelados em nitrogênio líquido e conservados a -80° até a extração de RNA. Após a extração o RNA total será transcrito reversamente em cDNA, para a análise de PCR em tempo real que será realizada em triplicata utilizando o termociclador ViiA7 (ThermoFisher).