Avaliação de inibidores de vias de sinalização como tratamentos para a fibrose cardíaca na doença de Chagasvoltar para a edição atual

Justificativa e Relevância. A fibrose intersticial é um fator determinante para as manifestações patogênicas da doença de Chagas. Ensaios clínicos mostraram forte correlação entre o percentual de fibrose tecidual e o baixo índice de fração de ejeção ventricular de pacientes com doença de Chagas 1. A única droga disponível para o tratamento da doença, o Benzonidazol, reduz a carga parasitária durante a fase crônica com eficácia variável, mas quando administrado a pacientes com cardiomiopatia avançada, não resultou em melhora do desfecho clínico2. Assim, o desenvolvimento de terapias visando o tratamento da fibrose são necessários para serem administrados em combinação com agentes tripanocidas, possibilitando uma melhora clínica significativa para cardiomiopatia avançada. Dados de fosfoproteômica do nosso grupo sugeriram a ativação das vias de sinalização DYRK2, AMPK2, NDRG2, JNK e p38 durante a infecção crônica experimental3 . Assim, nos propomos a validar esses alvos e avaliar se inibidores dessas vias podem prevenir o aumento de colágeno em modelos in vitro de fibrose cardíaca durante interação com T. cruzi. Objetivos. Investigar a fosforilação de DYRK2, AMPK2 e NDRG2 durante a interação fibroblastos cardíacos – T. cruzi; quantificar a expressão de colágeno por FC tratados com inibidores destas vias de sinalização; avaliar o papel de inibidores de DYRK2, AMPK2, NDRG2, JNK e p38 na proliferação de FC após contato com o patógeno. Metodologia. Células e parasitas- Fibroblastos cardíacos (FC) serão purificados a partir de passagens sucessivas de culturas de cardiomiócitos, como descrito anteriormente4. Serão utilizadas para as análises formas tripomastigotas de T. cruzi, cepa Brazil, derivadas de cultivo celular; Western blot –Proteínas totais de extratos de FC infectados por 48h pelo T. cruzi, ou FC estimulados com meio condicionado por parasitas ou soro de camundongos infectados serão separados por SDS-PAGE, transferidos para membrana de nitrocelulose e DYRK2, AMPK2, NDRG2, JNK e p38 fosforiladas serão detectadas com anticorpos específicos; Quantificação de colágeno- – Culturas de FC nas mesmas condições acima serão tratadas com inibidores de DYRK2, AMPK2, JNK e p38, e RNAi para NDRG2. As culturas serão fixadas e coradas com corante Sirius Red/Fast Green por 2h, o que permite a medida semiquantitativa do conteúdo de colágeno e proteínas não colágenas em cultura5. Após lavagem, o corante é extraído das células com solução de NaOH 0,1 N /Metanol 1:1. As absorbâncias dos sobrenadantes resultantes são lidas no leitor de microplacas Spectramax M2 (Molecular Devices) a ? 540 e 605 nm5; Ensaios de proliferação celular- FC serão cultivados submetidos a estimulação de colágeno (via infecção direta, ou exposição a antígenos do parasita)e tratados com inibidores da via de sinalização. A proliferação será avaliada a partir da medida de incorporação 5-bromo-2’-deoxiuridina (BrDU). Após fixação, as células serão incubadas com anticorpo anti-BrDU conjugado a peroxidase. Em seguida, o complexo antígeno-anticorpo será detectado pela adição do substrato tetrametilbenzidina (TMB) e a DO será obtida por leitura em ?450 nm em leitor de microplacas Spectramax M2 (Molecular Devices). Referências Bibliográficas. 1. Tassi EM et al Arq Bras Cardiol 102, 456 (2014). 2. Morillo C et al. N Engl J Med 373, 1295 (2015). 3. Wozniak JM et al. PLOS NEGL TROP DIS 14, e0007980 (2020). 4. Silva TA et al Int J Mol Sci 20, (2019). 5. Houghton PE et al Wound Repair and Regeneration 4, 489–495 (1996).