Identificação de mutações em pmrAB e phoPQ com papel funcional em resistência a polimixinas em isolados clínicos MDR de Klebsiella pneumoniaevoltar para a edição atual

Intro e justificativa: As polimixinas (PMs) têm ação potente sobre bactérias Gram-negativas, mas seu uso foi abandonado devido a efeitos adversos. Com a disseminação global de linhagens resistentes aos carbapenemas e à falta de novos antimicrobianos, as PMs estão novamente em uso como antibióticos de último recurso. Como consequência, a resistência a esses antimicrobianos aumentou, o que é motivo de grande preocupação. Mutações nos sistemas de dois componentes phoPQ e pmrAB de Klebsiella pneumoniae (KP) são importantes pois resultam em ganho de função, mediante ativação constitutiva dos operons arnBCADTEF, pmrE e pmrCAB, que codificam as enzimas responsáveis pelas modificações no LPS associadas a resistência a PMs. Um amplo estudo com 149 isolados de KP PM-R da Coleção de Bactérias de Infecção Hospitalar (albergada no LabSUR) identificou 54 mutações não sinônimas nos genes phoPQ e pmrAB, das quais 13 ocorrem em isolados com o gene mgrB intacto. Isto é relevante pois MgrB mantém PhoQ inativo, de modo que sua inativação também resulta em resistência, ao ativar o sistema PhoPQ. Vários dos isolados foram identificados em clones de grande relevância epidemiológica, dada sua ampla distribuição no Brasil. Porém, ainda que haja uma relação causal entre mutações nestes genes e o fenótipo de resistência, não se sabe quais das centenas de variações descritas na literatura são alelos (e não impactam em resistência) e quais são mutações que modulam a função das proteínas e têm papel em resistência. Assim, o objetivo deste subprojeto é identificar quais das 13 variações de fato conferem resistência a PMs, mediante ensaios de complementação dos genes mutantes em cepas de KP knock out de pmrAB ou phoPQ. Este subprojeto está inserido no contexto de um projeto mais amplo, que visa analisar as bases mecanisticas de como as substituições em PmrAB e PhoPQ causam resistência a PMs. Os dados vão gerar conhecimento sobre as bases moleculares deste processo e contribuir ao desenho de testes de diagnóstico baseados em ácidos nucleicos. Metodologia: O sistema lambda red está sendo usado para construir cepas recombinantes de KP knock out de phoPQ ou pmrAB. Estas serão complementadas com plasmídeos carreando os operons phoPQ ou pmrAB com sequência selvagem ou com as variações codificando as 13 substituições. Os plasmídeos selvagens foram adquiridos mediante síntese gênica e as mutações serão introduzidas por mutagênese sítio dirigida. KP carreando os plasmídeos de complementação passarão por teste de sensibilidade para verificar como as mutações impactam na concentração inibitória mínima (CIM) de PMs. Resultados: Identificamos o isolado KP 33271 como adequado para as atividades do projeto ao verificar que não é hipermucoviscoso e é sensível aos antibióticos usados nos métodos de tecnologia do DNA recombinante a serem realizados. Padronizamos o protocolo de preparação de células competentes, nas quais os plasmídeos de complementação de phoPQ e pmrAB foram introduzidos e os testes de CIM estão entrando em padronização. Em paralelo, KP foi transformada com pSIM18, que expressa as recombinases do sistema lambda red mediante choque térmico. Cassetes de resistência a Canamicina flanqueados por sequências de phoPQ e pmrB foram amplificados a partir do plasmídeo pKD13, e estão sendo transformados em KP (carreando pSIM18) para gerar a deleção das regiões phoPQ e pmrAB. Conclusão e perspectivas: A partir das atividades realizadas, duas etapas chave serão executadas: a padronização da CIM de PMs das KP recombinantes e a obtenção e checagem dos mutantes knock out pmrAB e phoPQ. Referência: Conceição-Neto OC, da Costa BS, Pontes LD, Silveira MC, Justo-da-Silva LH, de Oliveira Santos IC, Teixeira CB, Tavares e Oliveira TR, Hermes FS, Galvão TC, Antunes LC. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 2022:1012.