Filogeografia dos vetores da febre amarela Haemagogus janthinomys e Haemagogus capricornii na Mata Atlânticavoltar para a edição atual

Justificativa e Relevância Entre 2015-2017, foi registrada a reemergência do vírus amarílico (YFV) no Brasil, se alastrando na região silvestre de sua área endêmica (Amazônia e parte do Centro-oeste) para a Mata Atlântica, região considerada indene por quase 80 anos (Abreu et al. 2019). Identificar corretamente os vetores responsáveis pela transmissão do vírus é fundamental para o mapeamento de riscos de transmissão. Neste bioma está presente o vetor primário da doença, Haemagogus janthinomys, que é encontrado em praticamente toda a região tropical das Américas. Esta espécie é ocorre em simpatia em grande parte da distribuição de Hg. capricornii, que é restrita a Mata Atlântica da região sudeste e do sul da Bahia. Estas espécies são diferenciáveis apenas a partir da genitália masculina, pelo olhar de taxonomistas experientes (Silva et al. 2019). Dada a co-ocorrência e a falta de caracteres diagnósticos adicionais, restam ainda dúvidas se Hg. janthinomys e Hg. capricornii representam na realidade variações fenotípicas de uma mesma espécie. No caso de no fato serem unidades taxonômicas distintas, ainda não se sabe de fato o papel epidemiológico que a última espécie tem na Mata Atlântica. Objetivos Gerais e Específicos Analisar filogeneticamente o status taxonômico de Hg. janthinomys e Hg. capricornii e o papel epidemiológico de ambas as espécies no último surto de YFV na Mata Atlântica. Objetivos específicos - Desenhar iniciadores específicos para a amplificação de fragmentos dos genes citocromo oxidase II (coxII) e citocromo b (cytb) com base no genoma mitocondrial de Hg. janthinomys. - Sequenciar para populações de Hg. janthinomys e Hg. capricornii os dois marcadores mitocondriais (coxII e cytb), além de um marcador ribossomal (ITS-2) e um nuclear (white). - - Analisar filogeneticamente os marcadores moleculares sequenciados. - Genotipar amostras positivas para YFV. Metodologia Resumida Amostragem Foram coletados 643 espécimes de Hg. janthinomys/capricornii em 30 localidades da Mata Atlântica, dos estados do Rio de Janeiro, Minas Gerais e São Paulo (SISBIO 52472-5, INEA 019/2018). Ao todo, foram feitos 162 pools, dos quais 20 foram positivos para YFV (12,3%). Sessenta machos de 10 localidades da Mata Atlântica foram separados para as análises filogenéticas, dos quais a partir da identificação morfológica de suas genitálias observamos que 25 são Hg. capricornii e 35 são Hg. janthinomys. Desenvolvimento de iniciadores O desenvolvimento de iniciadores para coxII e cytb mtDNA será feito utilizando os programas Primer3 e a ferramenta Blast, disponíveis online (Primer-Blast). O genoma mitocondrial de Hg. janthinomys (NC_028025) será utilizado como modelo. Pretende-se amplificar um fragmento de 500-850pb de cada marcador. Extração de DNA, PCR, Sequenciamento e Análises Filogenéticas A extração de DNA será feita utilizando o kit DNA Tissue and Blood (Quiagen). A amplificação dos fragmentos do gene white e ITS-2 serão feitas com iniciadores e condições já publicados (Wesson et al. 1992; Redenbach et al. 2009). Diferentes concentrações de reagentes e de ciclagem da PCR serão testadas para coxII e cytb. As amostras serão submetidas a reações de sequenciamento pelo método de Sanger, como descrito em Ribeiro et al. (2020). O sequenciamento será realizado no ABI 3730 (Applied Biosystems) na Plataforma PDTIS/FIOCRUZ. O tratamento das sequências, assim como as análises filogenéticas serão feitas por métodos de distância genética e de reconstrução pelos métodos de máxima verossimilhança e inferência bayesiana, assim como descritos em Ribeiro et al. (2021). Caso seja possível diferenciar Hg. janthinomys de Hg. capricornii, os marcadores mais variáveis entre as espécies serão utilizados para identificação dos insetos presentes nos pools positivos para YFV (uma alíquota de cada espécime que compõem os 20 pools positivos está armazenada em freezer). Cronograma Meses 1-5: Desenho de iniciadores para os genes coxII e cytb e ensaios da PCR. Meses 6-10: Amplificação dos fragmentos e sequenciamento de DNA dos quatro marcadores. Meses 8-12: Análises filogenéticas, escrita de relatórios e artigo científico. Bibliografia Abreu et al. Emerg Microb Infect 8, 218 (2019) Reidenbach et al. BMC Evol Biol 9, 298 (2009) Ribeiro et al. Zootaxa 4830 (2020) Ribeiro et al. Zootaxa 4999, 534 (2021) Silva et al. Rev Soc Med Trop 52 (2019) Wesson et al. Mol Phyloget Evol 1, 253 (1992)